猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用

论文摘要

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测猪δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。参照GenBank中PDCoV有关基因序列,设计一对特异性引物用于扩增PDCoV M基因。将测序正确的基因片段克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒作为建立标准曲线的病毒模板。设计合成一对特异性引物与TaqMan探针,进行反应条件和反应体系的优化,建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并进行该方法的灵敏性、特异性与重复性验证。结果表明,该方法能有效扩增1.0×101～1.0×109拷贝·μL-1的PDCoV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为1.0×101拷贝·μL-1;对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数（CV）小于1%,重复性良好。对2017—2018年期间收集的河南省不同猪场的100份腹泻病料进行检测,PDCoV的阳性检出率为23%（23/100）,与PDCoV SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。人工感染PDCoV的仔猪,取攻毒后不同时间的粪便样品,应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度远远优于常规RT-PCR。上述结果表明,本研究所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法能够灵敏、特异地检测PDCoV,可用于临床PDCoV的检测。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 试验材料
•     1.1.1 病料与毒株
•     1.1.2 实验动物
•     1.1.3 主要试剂及仪器
•     1.1.4 标准质粒构建
•     1.1.5 定量引物、探针的设计与合成
•   1.2 试验方法
•     1.2.1 荧光定量RT-PCR反应条件与反应体系优化
•     1.2.2 构建标准曲线
•     1.2.3 灵敏性试验
•     1.2.4 特异性试验
•     1.2.5 重复性试验
•     1.2.6 临床病料检测
•     1.2.7 攻毒结果检测
• 2 结 果
•   2.1 反应条件与反应体系优化
•   2.2 标准曲线的建立
•   2.3 灵敏性检测
•   2.4 特异性检测
•   2.5 重复性检测
•   2.6 临床样本检测
•   2.7 攻毒后粪样检测
• 3 讨 论
• 4 结 论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 郑兰兰,朱静静,王盼,舒燕,梁青青,李炳晓,王超群,魏战勇

关键词: 猪冠状病毒,荧光定量,检测

来源: 畜牧兽医学报 2019年06期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河南农业大学牧医工程学院,河南省动物性食品安全重点实验室

基金: 国家重点研发计划(2018YFD0501205),许昌市基础与前沿项目(JC2018005)

分类号: S852.651

页码: 1261-1267

总页数: 7

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