microRNA-7敲除小鼠模型的建立及雄性生殖力分析

论文摘要

microRNA-7是一种在各物种间序列高度保守的microRNA。已有研究表明,microRNA-7在疾病的发生、器官的发育、癌症的产生等生物活动中发挥着重要的作用,并且在内分泌器官中有较高水平的表达。然而,其在动物生殖发育过程中的作用及机理尚不明确。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了 microRNA-7三种亚型的基因敲除小鼠模型,并对其雄性生殖力进行了分析,为进一步研究microRNA-7在动物生殖发育过程中的作用奠定了基础。首先,利用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测了成年小鼠各组织器官中microRNA-7的表达水平。结果表明microRNA-7在垂体、下丘脑、肾上腺等内分泌组织中具有高水平的表达,并在睾丸、子宫、附睾等生殖器官中具有较高水平的表达。此外,原位杂交检测结果表明,microRNA-7在小鼠睾丸中的支持细胞及各阶段生殖细胞中均有表达。其次,利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术,构建了 microRNA-7a1、microRNA-7a2以及microRNA-7b基因敲除小鼠模型。通过采用目标基因PCR扩增、测序、Real-time PCR的检测方法,对小鼠模型进行鉴定,结果表明microRNA-7三种亚型基因敲除小鼠均为基因序列大片段缺失个体,且缺失位于microRNA-7成熟序列区域。microRNA-7三种亚型基因敲除小鼠的microRNA-7基因表达水平都有极显著的降低。利用T7EI法对基因敲除小鼠潜在脱靶基因进行检测,结果表明三种microRNA-7基因敲除小鼠模型中均不存在脱靶效应。对microRNA-7三种亚型基因敲除小鼠模型的表型分析,发现基因敲除小鼠的出生率和成活率较野生型小鼠相比无明显差异。microRNA-7a2基因敲除成年小鼠的睾丸、附睾、子宫组织的体积与重量较野生型相比有显著性的减小和降低。但microRNA-7a1和microRNA-7b基因敲除成年小鼠各组织器官重量和形态与野生型小鼠相比无明显差异。配种实验结果表明,microRNA-7a2基因的缺失会导致雄性和雌性小鼠的不育,然而microRNA-7a1和microRNA-7b基因敲除小鼠与野生型小鼠相比繁殖力无显著性差异。对microRNA-7a2基因敲除成年小鼠睾丸和附睾组织进行切片染色观察,结果显示,睾丸中部分曲细精管的生精上皮中有空洞产生,附睾组织结构无明显变化,但附睾尾管腔中精子的数量明显减少。对microRNA-7a2基因敲除雄性小鼠精子活力检测发现,其精子数目、精子运动能力都较野生型小鼠相比有显著性的降低。血清中促性腺激素检测表明,雄性microRNA-7a2基因敲除小鼠血清中促卵泡激素（FSH）与黄体生成素（LH）的激素水平均有显著性的下降。最后,为进一步研究microRNA-7a2在雄性小鼠生殖系统中的作用和功能,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功的构建了 Loxp序列标记的microRNA-7a2的转基因小鼠模型（microRNA-7a2flox/flox）,为microRNA-7a2条件性基因敲除小鼠模型的建立奠定了基础。本研究结果表明,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的microRNA-7三种亚型基因敲除小鼠模型具有高可靠性,可以用于microRNA-7功能及其作用机理的研究。另外,本研究结果表明microRNA-7a2的缺失会造成雄性小鼠不育,生殖系统功能的改变,说明microRNA-7a2在小鼠的生殖发育中发挥着重要的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
•   1.1 microRNA概述
•     1.1.1 microRNA的生物合成、加工与表达
•     1.1.2 microRNA调控基因表达的机理
•     1.1.3 microRNA的功能
•   1.2 microRNA-7研究概述
•     1.2.1 microRNA-7的表达
•     1.2.2 microRNA-7与胰脏
•     1.2.3 microRNA-7与大脑
•     1.2.4 microRNA-7与糖尿病
•     1.2.5 microRNA-7与癌症
•   1.3 CRISPR/Cas9在基因编辑中的研究概述
•     1.3.1 CRISPR/Cas系统概述
•     1.3.2 CRISPR/Cas系统基本工作原理与特点
•     1.3.3 CRISPR/Cas9中sgRNA打靶位点的选择
•     1.3.4 CRISPR/Cas9在基因组编辑中的应用与展望
•   1.4 研究意义与目的
• 第二章 实验材料和方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验动物
•     2.1.2 CRISPR/Cas9基因编辑体外转录质粒
•     2.1.3 主要引物
•   2.2 主要仪器和设备
•   2.3 主要试剂
•     2.3.1 质粒构建
•     2.3.2 体外转录
•     2.3.3 实时荧光定量PCR及普通PCR
•     2.3.4 胚胎体外培养及显微注射操作
•     2.3.5 原位杂交及组织学染色
•     2.3.6 动物实验
•   2.4 主要溶液的配制
•     2.4.1 质粒构建
•     2.4.2 原位杂交及组织学染色
•     2.4.3 实时荧光定量PCR及普通PCR
•     2.4.4 胚胎体外培养及显微注射操作
•     2.4.5 动物实验
•   2.5 实验方法
•     2.5.1 动物处理和组织采样
•     2.5.2 动物组织中总RNA提取
•     2.5.3 普通mRNA的反转录
•     2.5.4 microRNA的反转录
•     2.5.5 实时定量PCR （Real-time PCR）
•     2.5.6 小鼠基因组DNA的粗提取
•     2.5.7 小鼠基因组DNA的提取
•     2.5.8 试剂盒小量提取质粒
•     2.5.9 PCR产物和酶切产物的回收纯化
•     2.5.10 琼脂糖凝胶PCR产物回收纯化
•     2.5.11 CRISPR/Cas9 SgRNA识别位点设计与产生
•     2.5.12 DNA连接
•     2.5.13 连接产物的转化及阳性克隆菌落的鉴定
•     2.5.14 体外转录
•     2.5.15 T7EI核酸内切酶（T7 Endonuclease Ⅰ）法检测基因突变
•     2.5.16 小鼠受精卵显微注射及胚胎移植
•     2.5.17 原位杂交
•     2.5.18 HE染色
•     2.5.19 组织免疫荧光染色
•     2.5.20 小鼠生长发育曲线绘制
•     2.5.21 小鼠主要器官重的统计
•     2.5.22 小鼠配种实验
•     2.5.23 雄性小鼠附睾尾精子数量统计
•     2.5.24 雄性小鼠精子运动能力测定
•     2.5.25 数据分析
• 第三章 实验结果与分析
•   3.1 microRNA-7表达水平的检测
•     3.1.1 microRNA-7在小鼠各组织器官中表达水平的检测
•     3.1.2 microRNA-7在成年小鼠睾丸中的表达
•     3.1.3 microRNA-7在小鼠睾丸发育过程中的表达
•   3.2 microRNA-7全身性敲除小鼠模型的建立
•     3.2.1 sgRNA打靶位点序列的设计与制备
•     3.2.2 显微注射构建基因敲除小鼠
•     3.2.3 microRNA-7基因编辑小鼠的鉴定
•     3.2.4 microRNA-7基因敲除小鼠扩繁及敲除效率的检测
•     3.2.5 microRNA-7基因敲除小鼠脱靶效应的检测
•   3.3 microRNA-7基因缺失小鼠表型观察
•     3.3.1 microRNA-7基因缺失小鼠生长发育的情况
•     3.3.2 microRNA-7基因缺失对小鼠生殖能力的影响
•     3.3.3 microRNA-7a2基因缺失对小鼠睾丸发育的影响
•     3.3.4 microRNA-7a2基因缺失对小鼠附睾组织的影响
•     3.3.5 microRNA-7a2基因缺失对小鼠精子活力的影响
•     3.3.6 microRNA-7a2基因缺失对雄小鼠促性腺激素分泌的影响
• flox/flox转基因小鼠的构建'>  3.4 microRNA-7a2^flox/flox转基因小鼠的构建
•     3.4.1 sgRNA打靶位点、同源臂的设计与制备
• flox/flox转基因小鼠的鉴定'>    3.4.2 microRNA-7a2^flox/flox转基因小鼠的鉴定
•   3.5 结果分析与讨论
• 第四章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简介

文章来源

类型: 博士论文

作者: 林皓

导师: 崔胜

关键词: 小鼠敲除模型,雄性生殖力

来源: 中国农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 中国农业大学

分类号: Q492;Q78

总页数: 118

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