鸟类味觉基因的功能进化及苦味受体感知非苦味物质的初步研究

论文摘要

脊椎动物的五种基本味觉（甜、鲜、苦、酸、咸）对于动物在自然界中的生存至关重要。其中甜味觉和鲜味觉是通过三个G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCR）Tas1r1、Tas1r2 和 Tas1r3 以异源二聚体的形式介导的,Tas1r1+Tas1r3介导鲜味觉,Tas1r2+Tas1r3介导甜味觉;苦味觉是由2型味觉受体基因（Tas2rs）编码的G蛋白偶联受体介导的。本文从鲜味觉和苦味觉两种味觉形式的角度,以基因序列分析结合功能实验的手段,研究了鸟类味觉受体基因的功能进化。并进一步进行了人类苦味觉受体对于非苦味物质反应的探究,揭示了五种基本味觉形式以外的金属味觉的分子机制。首先,全面研究了雀小目鸟类的鲜味觉受体基因（Tas1r1/Tas1r3）的功能进化。鸟类的甜味觉受体基因Tas1r2普遍丢失。已有的研究显示,食花蜜的安氏蜂鸟（Calypte anna）在Tas1r2基因丢失的情况下,其鲜味觉受体Tas1r1+Tas1r3发生了功能转换,获得了对甜味的感知能力。雀小目鸟类物种繁多、食性多样,不乏一些食物成分中花蜜占据一定比例的鸟类。本研究中涉及的雀小目鸟类涵盖了雀小目三个总科（雀总科、翁总科、莺总科）中的31个物种。通过PCR扩增和本地BLAST的方法获取了Tas1r3基因的第三个外显子区域序列,其中29种鸟的序列未发生移码突变,山蓝仙鶲（Niltava banyumas）和北红尾鸲（Phoenicurus auroreus）除外。接着,我们对于获得的Tas1r3序列进行了选择压分析,结果显示Tas1r3基因在食花蜜的太阳鸟和啄花鸟中的进化速度比在非食花蜜鸟中的快,但并没有检测到正选择信号。我们还将物成分中花蜜占据一定比例的雀小目鸟类Tas1r3基因与蜂鸟的Tas1r3基因进行了趋同分析,结果表明太阳鸟和啄花鸟分化前的共同祖先的Tas1r3,绣眼鸟祖先的Tas1r3以及太平鸟（Bombycilla garrulus）的Tas1r3与蜂鸟的Tas1r3基因了发生趋同进化。然而细胞水平的功能实验结果显示,叉尾太阳鸟（Aethopyga christinae）和暗绿绣眼鸟（Zosterops japonicus）的Tas1r1+Tas1r3与其外类群相比并未出现功能转换,只能感知鲜味,不能感知甜味。也证实了鸟类Tas1r2基因的丢失会导致甜味觉的缺失。其次,本文对安氏蜂鸟的苦味觉受体基因（Tas2rs）进行了深入的研究。花蜜中含有多种苦味的次生代谢产物,作为对一些花卉访客的防御形式。相关的生态学假说提出,苦味的次生代谢产物可能使花蜜特异性地吸引少数传粉者,保持植物与传粉者间相互作用的专一性。为了佐证这一假说,我们研究了专食花蜜的安氏蜂鸟的Tas2rs功能变化,并与外类群烟囱雨燕（Chaetura pelagica）和卡氏夜鹰（Caprimulgus carolinensis）进行比较。随着鸟类基因组数据的公布,我们之前的工作已经确定了 48种鸟类所有完整的Tas2r基因的全长序列。我们发现在安氏蜂鸟中发生了特异性的Tas2r基因复制（n=5）,与其两个食虫的近缘物种烟囱雨燕（n=4）和卡氏夜鹰（n=3）相比,安氏蜂鸟拥有较多的Tas2r基因数目（n=6）。基于枝-位点模型和位点模型的选择压分析显示蜂鸟特异性的Tas2r1基因复制事件经历了正选择的作用。功能实验结果表明,由蜂鸟特异性基因复制产生的Tas2r1拷贝对于测试的苦味化合物表现出较高的敏感度并出现了新的功能,这可能使蜂鸟能够更敏感和特异性地检测到花蜜中的苦味物质。尽管长期以来人们一直认为苦味觉是一种天然的防御机制,防止摄入苦味和潜在有毒的食物,但蜂鸟苦味受体基因的功能增强和扩张表明这种以花蜜为食的鸟类与其食虫的近缘物种相比可能更倾向于一些苦的味道。此外,这项研究支持了苦味的花蜜对于某些传粉者具有特异性的作用,从而加强植物-传粉者的共生关系这一假说。除甜味、鲜味、苦味、酸味和咸味-即所谓的五种“基本”味觉形式以外,还存在一些其它的味道,例如辣味、清凉味、脂肪味、和金属味等。其中金属无机盐具备复杂的味道特性,然而金属味道的感知机制在很大程度上仍有争议。为了检测苦味受体基因是否能感知金属味道,本文对于人类苦味觉受体基因感知非苦味物质进行了研究。我们借助了细胞功能实验手段,用人类25个苦味觉受体筛选了多种金属盐离子。实验结果显示,Tas2r7受体对于我们所测试的所有二价和三价金属离子都有反应。相反,氯化钾作为一种一价盐,无法激活Tas2r7受体。表明Tas2r7受体可能作为一个广谱的二价和三价金属离子感受器。进一步的结构和功能分析显示了 Tas2r7受体的H943.37和E2647.32是其与金属离子相互作用的两个关键氨基酸残基。本研究揭示了感知金属味道的分子机制之一,证明了人类对于金属离子复杂味道特征的感知是可以通过苦味觉受体Tas2r7介导的。这一发现拓展了我们对于苦味受体基因配体范围的认知,为未来在鸟类中开展Tas2r感知非苦味物质的研究奠定了基础。

论文目录

• 论文创新点
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1 味觉作用机理
•     1.1 味觉概述
•     1.2 味觉细胞的类型
•     1.3 味觉信号转导通路
•   2 鸟类味觉受体基因的研究
•     2.1 鸟类的概述
•     2.2 鸟类Tas1r基因的研究进展
•     2.3 鸟类Tas2r基因的研究进展
•   3 五种味觉基本形式以外的味觉感知研究进展
•     3.1 灼热和寒冷味觉的分子机制
•     3.2 脂肪味觉的分子机制
•     3.3 金属味觉的分子机制
• 第二章 雀小目鸟类鲜味觉受体基因的进化
•   1 前言
•   2 材料和方法
•     2.1 研究对象
•     2.2 从鸟类基因组序列中进行数据搜索查找基因
•     2.3 PCR反应和DNA测序
•     2.4 选择压分析
•     2.5 趋同/平行进化分析
•     2.6 基于细胞水平的功能实验
•   3 结果
•     3.1 雀小目鸟类Tas1r3基因第三个外显子区域扩增结果
•     3.2 雀小目鸟类Tas1r3的选择压分析
•     3.3 食甜的雀小目鸟类Tas1r3与蜂鸟的趋同分析
•     3.4 雀小目鸟类Tas1r1-Tas1r3功能实验结果
•   4 讨论
•   本章小结
• 第三章 安氏蜂鸟苦味觉受体基因的功能分化
•   1 前言
•   2 材料和方法
•     2.1 序列数据
•     2.2 选择压分析
•     2.3 功能实验
•   3 结果
•     3.1 Tas2rs系统发育分析和命名
•     3.2 发生复制的Tas2r基因受到正选择
•     3.3 发生复制的Tas2r基因功能的改变
•   4 讨论
•   本章小结
• 第四章 金属离子激活人类苦味觉受体Tas2r7
•   1 前言
•   2 材料和方法
•     2.1 人类Tas2r载体的构建和定点突变体的制备
•     2.2 细胞的功能实验
•     2.3 免疫荧光实验
•     2.4 Tas2r7的分子建模
•   3 结果
•     3.1 鉴定能够检测金属离子的Tas2r
•     3.2 Tas2r7以剂量依赖性方式响应金属离子
•     3.3 Tas2r7是一个相对窄谱的受体
•     3.4 确定Tas2r7对于金属离子识别重要的氨基酸位点
•   4 讨论
•     4.1 Tas2r7作为金属离子感受器
•     4.2 金属离子与Tas2r7的相互作用
•     4.3 人类Tas2r7的口腔外潜在功能
• 第五章 结论与展望
•   1 结论
•   2 展望
• 参考文献
• 在校期间发表的论文
• 致谢
• 附录文件

文章来源

类型: 博士论文

作者: 王轶

导师: 赵华斌

关键词: 鸟类,食性,味觉受体基因,分子进化,苦味受体,金属味觉

来源: 武汉大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 武汉大学

分类号: Q953

DOI: 10.27379/d.cnki.gwhdu.2019.000097

总页数: 114

文件大小: 9268k