侯本新１霍振清１李海军２晏东２丁伟２易超２王海２王喜艳２（通讯作者）
（１海南省农垦三亚医院海南三亚５７２０００）
（２新疆医科大学附属肿瘤医院新疆乌鲁木齐８３００１１）
【中图分类号】Ｒ７３５．９【文献标识码】Ａ【文章编号】１５５０－１８６８（２０１４）１１
【摘要】目的：采用流式细胞术ＳＰ细胞分选法分离并鉴定胰腺癌ＳＰ细胞符合胰腺癌干细胞特性。方法：１）选用人胰腺癌细胞系ＢｘＰＣ－３、ＰＡＮＣ－１、ＳＷ１９９０，采用流式细胞术ＳＰ分选法分离出ＳＰ细胞；２）采用平板克隆实验、细胞分化实验、裸鼠成瘤实验研究ＳＰ细胞亚群的基本生物学特性。结果：１）人胰腺癌细胞系ＢｘＰＣ－３、ＰＡＮＣ－１、ＳＷ１９９０均含有ＳＰ细胞亚群，比例（％）分别是０．５８±０．０２，８．７４±０．３３，３．９２±０．１６；２）胰腺癌细胞ＳＰ细胞亚群和ｎｏｎ－ＳＰ细胞亚群克隆形成能力、增殖分化能力有差异（Ｐ＜０．０５），ＳＰ细胞具有更强的克隆形成能力和增殖分化能力；ＳＰ细胞的裸鼠成瘤能力至少是非ｎｏｎ－ＳＰ的１００倍。结论：胰腺癌ＳＰ细胞具有胰腺癌干细胞特性，流式细胞术ＳＰ分选法是分离胰腺癌干细胞的可靠方法。
【关键词】胰腺癌；ＣＳＣ；ＳＰ细胞
胰腺癌预后差，５年生存率不足５％，中位生存期仅６个月［１］，肿瘤干细胞（Ｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＣＳＣ）学说认为恶性肿瘤中存在极少数具有成体干细胞特征的细胞亚群［２］，是恶性肿瘤恶性生物学行为的根源［３］。本研究引入流式细胞术ＳＰ细胞分选法分离人胰腺癌细胞系ＳＰ细胞，初步探索胰腺癌ＳＰ细胞具有胰腺癌干细胞特性。
１材料与方法
１．１细胞培养与观察人胰腺癌细胞系购自上海中科院细胞库，采用体外细胞培养对人胰腺癌细胞系ＢｘＰＣ－３、ＰＡＮＣ－１、ＳＷ１９９０进行传代与培养，培养条件严格按照ＡＴＣＣ推荐条件执行。
１．２ＣＳＣ的分离与鉴定采用流式细胞术ＳＰ分选法，分离并鉴定ＳＰ细胞亚群具有ＣＳＣ特性。
２结果
2.１人胰腺癌细胞系流式细胞术ＳＰ分选
Ａ．流式细胞术ＳＰ选法分析人胰腺癌细胞系ＢｘＰＣ－３中ＳＰ细胞占０．５８％±０．０２％；
Ｂ．ＢｘＰＣ－３细胞经维拉帕米处理后ＳＰ细胞下降至０．０５％±０．００％；
Ｃ．ＰＡＮＣ－１中ＳＰ细胞占８．７４％±０．３３％；
Ｄ．ＰＡＮＣ－１细胞经维拉帕米处理后ＳＰ细胞下降至０．９１％±０．０８％。
２．２胰腺癌ＳＰ细胞具有胰腺癌ＣＳＣ的基本生物学特性
２．２．１胰腺癌ＳＰ细胞具有更强的体外增殖能力平板克隆形成实验分析人胰腺癌细胞系ＢｘＰＣ－３、ＰＡＮＣ－１细胞的ＳＰ细胞亚群和ｎｏｎ－ＳＰ细胞亚群克隆形成率，两细胞亚群的克隆形成率有统计学差别（Ｐ＜０．０５）。
３讨论
肿瘤干细胞理论认为恶性肿瘤是一种干细胞疾病［３］，获得高纯度的肿瘤干细胞是研究的基础，流式细胞术ＳＰ分选法［４］绕开ＣＳＣ表面标志物［５］，利用干细胞对Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２拒染的原理，为胰腺癌ＣＳＣ分离鉴定提供了新的思路。
本研究发现人胰腺癌细胞系ＢｘＰＣ－３、ＰＡＮＣ－１、ＳＷ１９９０都存在Ｖｅｒａｐａｍｉｌ敏感的ＳＰ细胞：ＢｘＰＣ－３中ＳＰ细胞含量０．５８％±０．０２％；ＰＡＮＣ－１中ＳＰ细胞含量８．７４％±０．３３％；ＳＷ１９９０中ＳＰ细胞含量３．９２％±０．１６％；加入维拉帕米［４］后ＳＰ细胞降低９０％左右，数量明显减少，证实三株人胰腺癌细胞系中确实存在ＳＰ细胞亚群存在。本课题ＳＰ细胞比例均高于文献等［６－７］的报道，这可能与细胞样本染色过程以及仪器的操作误差有关。
大量研究表明体细胞ＳＰ细胞亚群符合干细胞特点，ＳＰ细胞表型作为鉴定干细胞的标志之一，并可用于表面标志未知的干细胞的分离［４］。进一步研究相继在急性髓细胞样白血病、乳腺癌、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、黑色素瘤、卵巢癌、肝细胞癌、肺癌］、鼻咽癌、结肠癌等恶性肿瘤分离到具有干细胞特性的ＳＰ细胞，表明许多人类恶性肿瘤细胞中的ＳＰ细胞具有肿瘤干细胞样的特性［８］。
目前，从形态学上很难区分ＣＳＣ与肿瘤细胞间的差异，只能用功能学方法即对其自我更新并产生异质性肿瘤细胞的能力来鉴定ＣＳＣ。本实验通过平板克隆实验显示ＳＰ细胞具有更强的体外增殖能力：贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞［９］，ＳＰ细胞克隆形成率较高反映ＳＰ细胞增殖能力强。细胞分化实验中ＳＰ细胞亚群随着培养时间的延长ＳＰ细胞的比例逐渐减少，而ｎｏｎ－ＳＰ细胞的比例逐渐增加，表明ＳＰ细胞朝ｎｏｎ－ＳＰ细胞发生了转变，这结果也间接证明了胰腺癌干细胞具有分化潜能，经不对称分裂，分化产生异质性肿瘤细胞即ｎｏｎ－ＳＰ细胞。
高成瘤性是ＣＳＣ最重要的特征［１０］，体内成瘤实验较体外实验更能反应体内环境，是检验ＣＳＣ的最要手段之一。Ｃｈｉｂａ等［１１］发现：肝癌细胞系Ｈｕｈ７和ＰＬＣ／ＰＲＦ／５中１×１０３ＳＰ细胞可以在免疫缺陷小鼠（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）皮下成瘤，而皮下注射１×１０６ｎｏｎ－ＳＰ细胞也无法成瘤。此外皮下注射至少１×１０６未分选的Ｈｕｈ７和ＰＬＣ／ＰＲＦ／５方可成瘤，这说明ＳＰ细胞亚群至少体内成瘤能力方面强于普通培养未分选细胞，成瘤能力至少是ｎｏｎ－ＳＰ细胞的一千倍。本实验选用裸鼠成瘤实验模拟体内坏境，结果显示人胰腺细胞系中ＳＰ细胞较ｎｏｎ－ＳＰ细胞具有更强的体内成瘤能力，ＳＰ细胞具有更强的自我更新并产生异质性肿瘤细胞能力［３］，说明胰腺癌细胞系中ＳＰ细胞具备胰腺癌ＣＳＣ特性。本课题也发现ｎｏｎ－ＳＰ细胞也在裸鼠皮下形成了肿瘤，这可能的原因是ｎｏｎ－ＳＰ细胞中含有少量未分选干净的ＳＰ细胞，或者ｎｏｎ－ＳＰ细胞中本身就含有干细胞，ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２分选只是一种富集肿瘤干细胞的方法，而不能严格挑选肿瘤干细胞［１２］。
本研究采用流式细胞术ＳＰ细胞分选法分离出人胰腺癌细胞系ＳＰ细胞，证实三株人胰腺癌细胞系中确实存在ＳＰ细胞亚群；进而通过平板克隆实验、细胞分化实验、裸鼠成瘤实验检测胰腺癌细胞ＳＰ细胞亚群和ｎｏｎ－ＳＰ细胞亚群生物学功能差别，ＳＰ细胞亚群具有更强的自我更新和增殖分化能力，显示人胰腺癌细胞系的ＳＰ细胞具有胰腺癌干细胞的特征，ＳＰ细胞是富含胰腺癌干细胞的亚群，流式细胞术ＳＰ分选法是分离胰腺癌干细胞的可靠方法。新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目，项目编号：２０１１２１１Ａ０３７
参考文献
［１］ＣｈｅｎＷ，ＺｈｅｎｇＲ，ＺｈａｎｇＳ，ｅｔａｌ．ＲｅｐｏｒｔｏｆｉｎｃｉｄｅｎｃｅａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙｉｎＣｈｉｎａｃａｎｃｅｒｒｅｇｉｓｔｒｉｅｓ，２００９．ＣｈｉｎＪＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２０１３Ｆｅｂ；２５（１）：１０－２１．
［２］ＡｈｍｅｄＫ，ＬｙｎｃｈＤ，ＴａｍｓＫ，ｅｔａｌ．Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｃａｒｃｉｎｏｍａｏｆｐａｎｃｒｅａｓ：ａｒａｒｅｅｎｔｉｔｙｗｉｔｈａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｂｅｈａｖｉｏｒａｎｄｐｏｓｓｉｂｌｅｇｅｎｅｔｉｃｌｉｎｋ．ＳＤＭｅｄ．２０１４Ｍａｒ；６７（３）：９７－９．
［３］ＴａｎａｓｅＣＰ，ＮｅａｇｕＡＩ，ＮｅｃｕｌａＬＧ，ｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｏｎｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＷｏｒｌｄＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１４Ａｕｇ２１；２０（３１）：１０７９０－８０１．ｄｏｉ：１０．３７４８／ｗｊｇ．ｖ２０．ｉ３１．１０７９０．
［４］ＬａｐｉｄｏｔＴ，ＳｉｒａｒｄＣ，ＶｏｒｍｏｏｒＪ，ｅｔａｌ．ＡｃｅｌｌｉｎｉｔｉａｔｉｎｇｈｕｍａｎａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｌｅｕｋａｅｍｉａａｆｔｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｎｔｏＳＣＩＤｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９４Ｆｅｂ１７；３６７（６４６４）：６４５－８．
［５］ＵｍｅｂａｙａｓｈｉＭ，ＫｉｙｏｔａＡ，ＫｏｙａＮ，ｅｔａｌ．ＡｎｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅａｎｄＣＤ３－ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙｐｌｕｓａｃｔｉｖａｔｅｄＴ－ｃｅｌｌｓｃａｎｅｒａｄｉｃａｔｅｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｔｃａｎｃｅｒｓｔｅｍ－ｌｉｋｅｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ．ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ．２０１４Ａｕｇ；３４（８）：４５０９－１９．
［６］ＷａｎｇＹＨ，ＬｉＦ，ＬｕｏＢ，ＷａｎｇＸＨ，ｅｔａｌ．Ａｓｉｄｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｓｆｒｏｍａｈｕｍａｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｈａｒｂｏｒｓｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｎｅｏｐｌａｓｍａ．２００９；５６（５）：３７１－８．
［７］ＫａｂａｓｈｉｍａＡ，ＨｉｇｕｃｈｉＨ，ＴａｋａｉｓｈｉＨ，ｅｔａｌ．ＳｉｄｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｐｒｅｄｏｍｉｎａｔｅｓｉｎＴＧＦ－ｂｅｔａ－ｍｅｄｉａｔｅｄｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｏｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎ．ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ．２００９Ｊｕｎ１５；１２４（１２）：２７７１－９．
［８］ＲｉｃｈａｒｄＶ，ＮａｉｒＭＧ，ＳａｎｔｈｏｓｈＫｕｍａｒＴＲ，ＰｉｌｌａｉＭＲ．Ｓｉｄｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｃｅｌｌｓａｓｐｒｏｔｏｔｙｐｅｏｆｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ，ｔｕｍｏｒ－ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇｃｅｌｌｓ．ＢｉｏｍｅｄＲｅｓＩｎｔ．２０１３；２０１３：５１７２３７．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１３／５１７２３７．Ｅｐｕｂ２０１３Ｎｏｖ４．Ｒｅｖｉｅｗ．
［９］ＫｈｏｒａｓｈａｄＪＳ，ＤｅｉｎｉｎｇｅｒＭＷ，Ｏ＇ＨａｒｅＴ．ＮｅｗｃｏｎｃｅｐｔｓｆｏｒＣＭＬｃｌｏｎａｌｉｔｙ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１３Ｊａｎ；４（１）：７－８．
［１０］ＫｏｎｄｏＴ．Ｓｔｅｍｃｅｌｌ－ｌｉｋｅｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｉｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓ．ＣａｎｃｅｒＢｉｏｍａｒｋ．２００７；３（４－５）：２４５－５０．Ｒｅｖｉｅｗ．
［１１］ＣｈｉｂａＴ，ＫａｍｉｙａＡ，ＹｏｋｏｓｕｋａＯ，ｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ｒｅｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．２００９Ｄｅｃ２８；２８６（２）：１４５－５３．
［１２］ＨａｄｎａｇｙＡ，ＧａｂｏｕｒｙＬ，ＢｅａｕｌｌｅｕＲ，ｅｔａｌ．ＳＰａｎａｌｙｓｉｓｍａｙｂｅｕｓｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌＰｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＥｘｐＣｅｌｌＲｅｓ，２００６，３１２（１９）：３７０１－３７１０