汤艳群彭敏吕琼芳梁惠明吴雪缘
（广东省江门市药品检验所广东江门529030）
【摘要】目的：建立高效液相色谱-示差折光检测法测定紫冬油中冰片含量。方法：采用示差折光检测器，95%乙醇为提取溶剂，IntersilODS-SP色谱柱（150×4.6mm，5μm），以甲醇-水（50：50）为流动相，柱温30℃，流速为1.0mL﹒min-1，进样量为20μL。结果：冰片两峰分离良好，线性范围为冰片0.251～1.507mg﹒mL-1，r=0.9999。平均回收率(n=9)为98.3%（RSD=1.1%）。结论：本文方法简便快速，准确可靠，可作为本品的质量评价和生产工艺监控的有效方法。
【关键词】紫冬油；高效液相色谱法；示差折光检测器；冰片(龙脑）
【中图分类号】R453【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）10-0093-02
DeterminationofBorneolinComfreyOilbyHPLC-RIDTangYanqun,PengMin,LvQiongfang,LiangHuiming,WuXueyuan
JiangmenInstituteforDrugControl,Jiangmen,Guangdong529030,China
【Abstract】ObjectiveToestablishaHPLC-RIDmethodfordeterminationofborneolincomfreyoil.METHODSTheseparationwasperformedbyrefractiveindexdetector(RID).The95%ethanolwasusedasextractionsolvent.ThechromatographicanalysiswascarriedoutonanIntersilODS-SPcolumn(150×4.6mm，5μm).Themobilephaseconsistedofmethanol-water(50:50).Thecolumntemperaturewassetat30℃,flowratewas1.0mL﹒min-1andinjectionvolumewas20μL.RESULTSAgoodseparationbetweentwopeaksofborneolwasachieved.Agoodlinearitywasobtainedovertherangeof0.251～1.507mg﹒mL-1(r=0.9999).Theaveragerecovery(n=9)was98.3%(RSD=1.1%).CONCLUSIONThismethodissimple,quick,preciseandaccurate.Thismethodissuitableforcontrollingtheproductqualityandproductionprocess.
【Keywords】Comfreyoil;HPLC;RID;borneol
冰片是一味传统中药,具有开窍醒神，清热散毒，明目退翳的功效，常作为佐药与其他中药配伍使用，分为天然冰片和合成冰片。天然冰片根据其来源产地又可分为进口和国产两类进口天然冰片为龙脑香科植物龙脑香树树脂中析出的天然结晶性化合物或龙脑香树干经蒸馏冷却得到的结晶性化合物,其中右旋龙脑含量通常在98%以上,主产于印度尼西亚,被视为冰片中的正品,但其资源相对稀缺,价格比较昂贵。国产天然冰片来源于樟属植物中的香樟、油樟和阴香,产地主要分布于福建、四川、云南等地区。作为商品的冰片还有艾片（左旋龙脑）,是菊科植物艾纳香Blumeabalsamifera(L.)DC.的新鲜叶经提取加工制成的结晶冰片物,产于贵州、广东、广西、云南等地[1]。由于药用资源稀缺,现主要用樟脑、松节油等为原料,经化学方法合成冰片。合成冰片也叫合成龙脑，主要成分是互为异构体的龙脑和异龙脑[2]，是没有旋光的消旋龙脑[3]。
文献报道冰片含量测定的方法有气相色谱法[4,5]、衍生化高效液相色谱法[2]、薄层色谱法[6]、红外光谱法[7]、紫外-可见分光光度法[3]、重量法[8]等。未见报道用高效液相色谱-示差折光检测法。本试验尝试建立HPLC-RID法测定医院制剂紫冬油中冰片含量，此方法简单易行，快速，结果准确，便于医院对此品种的生产工艺和产品质量进行考察，同时为不同环境和条件下冰片及其制剂质量控制提供参考。
1.仪器与试药
日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪：LC-20AT系列，RID-10A示差折光检测器（岛津公司）；METTLERTOLEDOXS205DU电子天平（METTLERTOLEDO公司）；KQ-700A型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。
紫冬油（批号20140708、20140818、20140926）及阴性样品均由江门市某中医院提供；冰片对照品（（±）-Borneoland（±）-Isoborneol，含量98.0%，批号110743-200905）由中国药品生物制品检定所提供；试验用水为超纯水；甲醇(HPLC级，批号100296)。
2.方法与结果
2.1色谱条件及系统适用性试验
色谱柱：IntersilODS-SP色谱柱（150×4.6mm，5(μm）；流动相：甲醇-水（50:50）；柱温：30℃；流速：1.0mL﹒min-1；进样量：20μL。在此色谱条件下冰片两峰的分离效果良好，可达2.5左右，理论塔板数均不低于5000。
2.2含量测定方法
用内容量移液管精密量取供试品3mL，置10mL量瓶中，用95%乙醇分次洗涤移液管内壁,洗液并入量瓶中，超声处理（功率250W，频率40kHz)10分钟，用95%乙醇稀释至刻度,摇匀,静置后取上清液，滤过，作为供试品溶液；另取冰片对照品适量，精密称定，同法制成每1mL中含1mg的溶液作为对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件，分别量取供试品溶液及对照品溶液各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。
2.3专属性试验
按处方比例配制除冰片外的其他组分的阴性样品，按“2.2”项下的方法测定。结果表明，空白组分对测定无干扰，见图1。
图1专属性考察HPLC色谱图
A.95%乙醇；B阴性样品溶液；C.对照品溶液；D.供试品溶液
1.龙脑；2.异龙脑
Fig.1HPLCchromatographyofspecificitystudy
A.95%ethanol;B.negativecontrolsubstance;C.reference;D.sample
1.borneol；2.isoborneol
2.4线性试验
精密称取冰片对照品125mg，置50mL量瓶中，用95%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液；分别精密量取1,2,3,4,5,6mL，置10mL量瓶中，用95%乙醇稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件，以质量浓度(X)为横坐标，两峰面积和(Y)为纵坐标做线性回归。得回归方程为：Y=177.0X-2756，r=0.9999。
结果表明，冰片在0.251～1.507mg﹒mL-1内线性关系良好。
2.5稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10，12，15小时测定峰面积，RSD为1.2%。结果表明，供试品溶液在15小时内基本稳定。
2.6重复性试验
取同一批号的样品6份，照样品测定下的方法测定，RSD为1.2%（n=6）。结果表明，平行测定法具有良好的重复性。
2.7精密度试验
取供试品溶液1份，连续进样6次，记录峰面积，RSD为0.5%。结果表明进样精密度良好。
2.8回收率试验
取同一供试品溶液3ml，加入对照品适量，制成混合溶液的浓度分别为标示量的80%、100%、120%的模拟回收样品9份，按“2.2”项下的制备供试液，进样测定，计算回收率，平均回收率(n=9)为98.3%（RSD=1.1%），说明本法回收率良好，见表1。
2.9样品含量测定
取3个批次的供试品，按“2.2”项下的方法测定。按外标法计算各组分的含量，结果见表2。
表2样品含量测定结果
Tab.2Resultsofassay
批号冰片含量（mg﹒mL-1)
13.5
24.0
33.6
3.讨论
3.1测定方法的选择
前文提及冰片含量分析方法有多种，薄层色谱法、红外光谱法、紫外-可见分光光度法、重量法等由于误差大或易受检测环境、时间等诸多因素影响[9]而不被常用。目前冰片含量分析仍较多采用气相色谱法。鉴于基层医院的实验室多数已配备高效液相色谱仪，重新购置气相色谱仪不仅价格昂贵且使用频率、普遍性不及液相，所以基层医院的医院制剂使用气相色谱法来分析不太现实。而报道的衍生化高效液相色谱法是将冰片进行柱前衍生后，用紫外检测器来间接完成冰片的含量测定，操作繁琐，且毒性较大。与紫外检测器相比，示差折光检测器（RefractiveIndexDetector，RID）是一种通用型检测器,它是根据不同物质具有不同折射率来进行组分检测的，具有广泛的适用性，对于冰片这类没有紫外吸收的物质也能够检测。因此，在不苛求灵敏度的情况下，可以考虑用示差折光检测器。紫冬油中冰片量较大（理论量3.2mg﹒mL-1)，所以HPLC-RID法直接测定紫冬油中冰片含量应该可行。方法学考察结果证实，该方法简便、快速、准确、安全及重现性好。
3.2流动相的选择
药典提出反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统。曾尝试不同比例的甲醇-水系统，发现甲醇-水（50：50）时冰片两峰的分离度是最佳的且干扰峰最少。提高甲醇比例，分离度变差，而降低则只有溶剂峰出。
3.3提取溶剂的选择
冰片在乙醇、三氯甲烷或乙醚中易溶，在水中几乎不溶[5]，也有文献[3]曾用无水乙醇溶解。从经济、环保等角度考虑，最终选95%乙醇作为提取溶剂。因冰片易挥发提取时间不宜长，提取过程必要时注意控温。
3.4方法建立的现实意义
按照配方计算该品种冰片的理论含量为3.2mg﹒mL-1，从表2数据得知，实际测得含量均偏高，且3批间含量测定结果相差较大。但各批含量经反复多次测定，数据基本相近，表明该方法本身准确可靠。测定结果的偏差反映出该品种生产工艺不够稳定，亟待改进。目前基层医院的医院制剂有很多是主要依靠人工操作，在制备的过程中存在着投料不均匀、搅拌不均匀等问题，这就很可能导致含量的偏差较大。此次建立的高效液相色谱-示差折光检测法既简便又快速准确，便于医院对此品种的生产工艺进行有效监控，对其质量做出及时准确的评价，以指导其逐步优化生产工艺，提高产品质量。另外，此方法有可能适用于其他含冰片的中成药的质量控制或为研究人员提供一种新思路。
【参考文献】
[1]黄卫东,吕武清.冰片的研究进展[J].中国药业,2008,17(4):64-66.
[2]石茹,高苏莉.高效液相色谱衍生化法测定脑脉康中冰片含量[J].第四军医大学学报,2003,24(5):449-451.
[3]李光文,孙媛媛,姚宏.通过与香草醛的显色反应检测冰片成分[J].理化检验(化学分册),2008,44:1083-1107.
[4]伍朝筼,蒋学华,马鹏等.毛细管气相色谱法测定冰片及含冰片中成药中龙脑和异龙脑的含量.华西药学杂志,1989,4(1):9-12.
[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:136-137.
[6]王道芳,李有文.用TLC法定性鉴别咽喉康胶囊中大黄、黄连和冰片[J].安徽医药,2006,10(3):191.
[7]谷筱玉,汪嚥,徐可欣等.冰片的近红外光谱法检测[J].光谱学与光谱分析,2004,24(2):155-157.
[8]熊国运,杨华,赖志娟等.重量法测定牛黄解毒片中冰片含量[J].中成药,1990,12（8）:15
[9]汪汝沛,戚进,余伯阳.冰片含量测定方法研究进展[J].药学进展,2010,34（8）:359-364.