α-L-鼠李糖苷酶HFM-Rha78的酶学性质及其催化作用研究

论文摘要

α-L-鼠李糖苷酶特异性地切割天然产物末端的α-鼠李糖基,有效地提高了这些天然产物的生物活性和生物利用度。本课题组通过基于保守基序的PCR和人粪便宏基因组高通量测序,获得了具有独立知识产权的新型α-L-鼠李糖苷酶HFM-Rha78。该酶分子质量为85.5kD,等电点为5.58。在克隆到载体pET-28a时,α-L-鼠李糖苷酶HFM-Rha78的N-末端携带（His）6标签。本论文对其酶学性质和生物转化进行系统的研究,为该酶的进一步应用提供依据,对于挖掘新型α-L-鼠李糖苷酶资源具有重要的意义和价值。生物信息学分析结果表明,HFM-Rha78的亲水性氨基酸分布均匀,无明显的疏水区,且总亲水性平均系数为﹣0.425,表现出亲水性。N端的原始剪切位点分值为0.135,信号肽平均分值为0.205,综合剪切位点分值为0.185,皆处于较低水平,说明该酶缺乏信号肽。HFM-Rha78的2级结构以α螺旋和无规则卷曲为主,分别占33.43%和41.47%,其余为β转角结构和延伸链,分别占6.8%和18.31%。该酶的催化广义酸和广义碱均是谷氨酸,催化残基高度保守。以对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷（p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside,pNPR）为底物,紫外-可见分光光度法测定HFM-Rha78的酶学性质。结果表明,最适反应条件为:磷酸缓冲液pH 6.5,反应温度50℃。该酶在46℃以下保温30 min,不会影响其酶活性,说明其具有一定的热稳定性。HFM-Rha78能普遍耐受低浓度（1%以下）的有机溶剂,且1%5%的异丙醇和1%的β-巯基乙醇还能够显著提高其酶活性。酶动力学实验证明HFM-Rha78对pNPR的亲和性较弱。采用高效液相色谱法,研究HFM-Rha78对黄酮苷类化合物芦丁、柚皮苷和橙皮苷的催化活性。结果表明,该酶均能专一性地将3种底物分别转化为异槲皮素、樱桃苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷,转化效率为柚皮苷（29）芦丁（29）橙皮苷。该酶水解芦丁、柚皮苷和橙皮苷的最适温度分别为39℃、45℃和42℃,最适pH为7.5、6.5和5.56.0。柚皮苷最适反应时间最短,为2 h,芦丁及橙皮苷的最适反应时间为12 h。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 α-L-鼠李糖苷酶
•     1.1.1 α-L-鼠李糖苷酶
•     1.1.2 HFM-Rha78
•   1.2 黄酮苷类化合物的应用
•     1.2.1 芦丁及异槲皮素的应用价值
•     1.2.2 柚皮苷及樱桃苷的应用价值
•     1.2.3 橙皮苷及橙皮素-7-O-葡萄糖苷的应用价值
•   1.3 常见研究方法
•     1.3.1 酶学性质检测方法
•     1.3.2 天然黄酮苷类化合物检测方法
•   1.4 本研究的目的及意义
• 第二章 HFM-Rha78 的生物信息学分析及酶学性质表征
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 实验仪器
•     2.1.4 生物信息学软件及分析
•     2.1.5 HFM-Rha78 的异源表达及纯化
•     2.1.6 酶活性测定方法
•     2.1.7 酶动力学常数测定方法
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 HFM-Rha78 生物信息学分析
•     2.2.2 HFM-Rha78与19 个已报导细菌源Rha78 的分子进化树
•     2.2.3 HFM-Rha78与GH78 亚家族Ⅱ多序列比对
•     2.2.4 HFM-Rha78 表达与纯化
•     2.2.5 HFM-Rha78 的酶学性质
•   2.3 小结与讨论
• 第三章 HFM-Rha78 水解黄酮苷类化合物的催化特性研究
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 芦丁及其水解产物异槲皮素的测定
•     3.1.3 芦丁水解最适反应条件的研究
•     3.1.4 芦丁水解最适反应条件的正交实验
•     3.1.5 柚皮苷及其水解产物樱桃苷的测定
•     3.1.6 柚皮苷水解最适反应条件的研究
•     3.1.7 柚皮苷水解最适反应条件的正交实验
•     3.1.8 橙皮苷及其水解产物橙皮素-7-O-葡萄糖苷的测定
•     3.1.9 橙皮苷水解最适反应条件的研究
•     3.1.10 橙皮苷水解最适反应条件的正交实验
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 芦丁水解最适反应条件
•     3.2.2 柚皮苷水解最适反应条件
•     3.2.3 橙皮苷水解最适反应条件
•     3.2.4 HFM-Rha78 转化芦丁、柚皮苷和橙皮苷的比较
•   3.3 小结与讨论
• 总结与展望
•   总结
•   展望
• 参考文献
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 史云璐

导师: 李艳琴,李彬春

关键词: 鼠李糖苷酶,生物信息学分析,酶学性质,黄酮苷的生物转化

来源: 山西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山西大学

分类号: Q55

DOI: 10.27284/d.cnki.gsxiu.2019.000183

总页数: 62

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