微藻-酵母相互作用机制的多组学分析及强化单细胞油脂生产研究

论文摘要

自然环境中不同物种之间的相互作用十分普遍。利用微生物之间的相互作用可达到提高废水处理、污染物降解效率的目的。一些微藻和酵母的人工组合在同一培养体系中可表现出动态的互利关系。目前,微藻-酵母共培养的研究主要集中在工艺优化方面,两物种之间相互作用机制尚不明确。本研究以小球藻和产油酵母为研究对象,筛选出具有协同作用的最佳组合,再利用代谢组学和转录组学等分析手段阐明共培养体系中两种微生物的相互作用机制。随后以木薯渣水解液为底物对其强化单细胞油脂生产进行了系统研究。主要研究内容如下:（1）采用共培养体系对几种小球藻及产油酵母的不同组合进行了综合评价,并验证了最优组合之间协同效应关系。结果表明,以起始接种密度比为3:1共培养的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）和粘红酵母（Rhodotorula glutinis）组合,相对于其他组合而言共生关系更加稳定,且生物量及油脂产率显著提高（p<0.05）。与单培养相比,共培养体系葡萄糖的消耗率及不饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例显著提高。在溶解氧及pH调节方面,上述微藻和酵母均表现出协同作用。（2）对筛选出的蛋白核小球藻-粘红酵母组合进行非接触式共培养,评价了两种微生物之间的相互作用对各自细胞生长及油脂积累带来的影响;基于GC/TOF-MS非靶向代谢组学研究了共培养体系中两物种胞内小分子代谢物谱的整体变化。结果表明,共培养体系中粘红酵母（R.glutinis）的细胞数量、中性脂荧光值显著高于单培养,且观察到更多的脂滴。与单培养相比,共培养中粘红酵母细胞内长链脂肪酸酸合成途径显著上调,与应激反应、防御抵抗以及调节渗透相关的肌醇、海藻糖、阿拉伯醇等代谢物丰度也显著上调。另一方面,共培养中蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa）叶绿素荧光更高,与之相对应的中间产物叶绿醇的丰度也显著上调。谷胱甘肽代谢相关的代谢物显著上调,以应对环境压力。（3）采用基于GC/TOF-MS的非靶向代谢组学分析研究了蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa）和粘红酵母（R.glutinis）在非接触共培养中胞外代谢物谱变化规律。通过建立Biplot、SUS-plot统计模型结合单变量分析筛选出了具有重要意义的差异性代谢物（biomarkers）,并对其生物学意义进行了分析和验证。结果表明甘油、丙酮酸、琥珀酸及水杨苷等四种代谢物只存在于共培养胞外环境中,而未在粘红酵母或蛋白核小球藻的单培养中检测到。十种分泌物存在于单培养环境中且共培养中该物质的丰度显著上调。包括色氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、泛酸、草酸、吲哚乙酸等。通过吲哚乙酸反加实验验证了其对粘红酵母（R.glutinis）的促生长作用。（4）基于转录组测序技术分别对蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa）和粘红酵母（R.glutinis）共培养前期的基因转录水平进行了全局性监测。蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa）响应共培养环境,可引起色氨酸及吲哚乙酸合成、卟啉和叶绿素代谢、泛醌和其他萜烯类醌的生物合成等生物学过程中相关酶的调控基因显著上调。粘红酵母（R.glutinis）响应共培养体系,可上调细胞内参与糖酵解、丙酮酸代谢及三羧酸循环等相关酶的基因表达水平,为脂肪酸的积累提供更多的碳骨架及能量。脂肪酸合成和延伸途径中关键酶的相关基因差异性表达。硬脂酸甘油酯去饱和酶（stearoyl-CoA desaturase）的相关基因表达水平剧烈上调（FC>20）,说明共培养条件下粘红酵母（R.glutinis）可通过合成更多不饱和脂肪酸来响应与蛋白核小球藻之间的相互作用。（5）研究了蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa）和粘红酵母（R.glutinis）共培养体系对非脱毒木薯渣水解物底物的微生物油脂生物转化能力。与单培养相比,共培养体系可得到更高的生物量(20.37±0.38 g L-1)和油脂产量(10.42±1.21 g L-1)。进一步采用补料分批培养,共培养体系的生物量和油脂产量分别提高到31.45±4.93 g L-1和18.47±3.25 g L-1。两种微生物对木薯渣水解液中的一些副产物均表现出高耐受性,且共培养体系可增强对有毒副产物的降解。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 引言
•   1.2 微藻-酵母共培养研究体系现状
•     1.2.1 微藻-酵母共培养体系的特征
•     1.2.2 微藻-酵母共培养体系的应用
•   1.3 多组学分析在微生物相互作用机制研究中的应用
•   1.4 单细胞油脂的研究进展
•     1.4.1 产油微生物
•     1.4.2 微藻油脂及其产油机制
•     1.4.3 酵母油脂及其产油机制
•     1.4.4 利用廉价碳源制备单细胞油脂
•       1.4.4.1 粗甘油
•       1.4.4.2 废水
•       1.4.4.3 木质纤维素水解液
•       1.4.4.4 疏水性废弃物
•   1.5 本论文的研究目的意义和内容
•     1.5.1 选题背景和研究意义
•     1.5.2 研究内容与技术路线
• 第二章 微藻-酵母共培养系统构建与强化单细胞油脂生产
•   2.1 引言
•   2.2 材料与仪器
•     2.2.1 实验材料
•     2.2.2 主要试剂
•     2.2.3 主要实验仪器
•   2.3 研究方法
•     2.3.1 微生物保存、活化及种子液制备
•     2.3.2 微藻-酵母共培养组合评价
•     2.3.3 分析与测试
•       2.3.3.1 基于流式细胞术的细胞计数及荧光测定
•       2.3.3.2 生物量干重浓度测定
•       2.3.3.3 总脂含量测定
•       2.3.3.4 培养液分析
•       2.3.3.5 脂肪酸含量及成分分析
•       2.3.3.6 统计分析
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 单培养和共培养中生物量积累与油脂生产
•     2.4.2 共培养对细胞形态、溶解氧、p H值和葡萄糖消耗的协同作用
•     2.4.3 C/N对共培养体系单细胞油脂积累的影响
•     2.4.4 脂肪酸成分
•   2.5 小结
• 第三章 非接触式共培养下胞内代谢途径调控规律研究
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 菌株与培养基
•     3.2.2 主要试剂
•     3.2.3 仪器与设备
•   3.3 研究方法
•     3.3.1 微生物培养保存与活化
•     3.3.2 微藻-酵母非接触式共培养
•     3.3.3 分析与测试
•       3.3.2.1 细胞计数及中性脂荧光分析
•       3.3.2.2 代谢组学样品制备
•       3.3.2.3 两步法衍生化反应
•       3.3.2.4 GC/TOF-MS分析代谢物谱
•       3.3.2.5 数据预处理
•       3.3.2.6 统计分析
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 细胞生长、色素含量和脂质积累
•     3.4.2 代谢组学分析
•       3.4.2.1 共培养中粘红酵母胞内代谢物谱变化
•       3.4.2.2 共培养中蛋白核小球藻胞内代谢物谱变化
•   3.5 小结
• 第四章 非接触式共培养下胞外代谢物谱变化规律研究
•   4.1 引言
•   4.2 材料与仪器
•     4.2.1 菌株
•     4.2.2 保存与活化
•     4.2.3 实验试剂
•     4.2.4 实验设备
•   4.3 实验方法
•     4.3.2 共培养实验设置
•     4.3.3 吲哚乙酸反加实验
•     4.3.4 代谢组学样品制备
•     4.3.5 两步法衍生化
•     4.3.6 基于GC/TOF-MS的代谢物谱分析
•     4.3.7 数据预处理
•     4.3.8 统计分析
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 统计分析方法的建立
•     4.4.2 非接触式共培养中胞外新代谢物的产生
•     4.4.3 非接触式共培养中显著上调的胞外代谢物
•   4.5 小结
• 第五章 共培养条件下微藻-酵母互作转录组学分析
•   5.1 引言
•   5.2 材料与方法
•     5.2.1 实验材料
•       5.2.1.1 实验菌株及培养基
•       5.2.1.2 实验试剂
•       5.2.1.3 仪器设备
•     5.2.2 研究方法
•       5.2.2.1 微生物培养及样品收集
•       5.2.2.2 总RNA提取和质量评估
•       5.2.2.3 cDNA文库构建和测序
•       5.2.2.4 测序数据质控
•       5.2.2.5 转录组从头组装及功能注释
•       5.2.2.6 基因表达水平及差异分析
•       5.2.2.7 差异基因的功能及通路富集分析
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 总RNA检测结果
•     5.3.2 测序文库及组装结果
•     5.3.3 基因功能注释
•     5.3.4 差异基因表达分析
•     5.3.5 共培养下蛋白核小球藻中关键代谢通路分析
•       5.3.5.1 色氨酸及吲哚乙酸合成
•       5.3.5.2 泛醌和其他萜烯类醌的生物合成
•       5.3.5.3 卟啉和叶绿素代谢
•     5.3.6 共培养下粘红酵母中关键代谢通路分析
•       5.3.6.1 糖酵解及丙酮酸代谢
•       5.3.6.2 三羧酸循环及脂肪酸合成
•   5.4 小结
• 第六章 微藻-酵母共培养强化木薯渣水解液转化单细胞油脂
•   6.1 引言
•   6.2 材料与仪器
•     6.2.1 微生物种类与培养基配制
•     6.2.2 木薯渣水解液的制备
•     6.2.3 主要试剂
•     6.2.4 实验仪器设备
•   6.3 研究方法
•     6.3.1 微生物保存与活化
•     6.3.2 分批培养
•     6.3.3 分析方法
•       6.3.3.1 流式细胞仪
•       6.3.3.2 生物量干重
•       6.3.3.3 总脂含量测定
•       6.3.3.4 脂肪酸含量和组成测定
•       6.3.3.5 培养液单糖和总糖浓度测定
•       6.3.3.6 培养基中副产物的测定
•   6.4 结果与讨论
•     6.4.1 共培养和单培养中细胞生长与产物合成规律
•       6.4.1.1 细胞数量变化
•       6.4.1.2 糖消耗与生物量产出
•       6.4.1.3 油脂合成及脂肪酸成分
•       6.4.1.4 培养基中木薯渣水解液副产品的降解
•       6.4.1.5 补料分批培养
•       6.4.1.6 文献对比讨论
•   6.5 小结
• 结论与展望
•   1、结论
•   2、创新点
•   3、展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘鹭

导师: 魏东

关键词: 蛋白核小球藻,粘红酵母,共培养,代谢组学,转录组学

来源: 华南理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 华南理工大学

分类号: Q938;TQ641

DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.000319

总页数: 146

文件大小: 8154K

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