两株鸡传染性支气管炎病毒的分离、全基因组测序及其S1基因的克隆表达

论文摘要

鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）感染引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。由于IBV基因组易发生变异和重组,IBV的基因型和血清型复杂多样,且不同血清型间交叉保护性效果不理想。新基因型甚至新血清型不断出现,给IBV的有效防控带来了巨大困难。本研究从疑似IBV感染的IBV免疫鸡群分离鉴定出2株IBV,并对其全基因组进了测序分析以及克隆表达了S1基因。为进一步了解丰富国内IBV流行株的重组变异情况,潜在的免疫逃逸机制以及疫苗毒株筛选依据等积累了数据。1、两株鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定本研究首先从疑似IBV感染的IBV免疫鸡群采集发病鸡脏器进行鸡胚接种病毒分离。5天后发现接种两个肾脏样品的鸡胚出现典型的卷曲侏儒胚。但其尿囊液不具有血凝现象,以尿囊液提取的RNA反转录的cDNA为模版。用IBV的S基因特异性引物进行了 PCR扩增鉴定,PCR扩增以及序列测序表明能从两个尿囊液样品中扩增出IBV的S基因特异性片段,同时将分离到的这两个毒株分别命名为IBV34以及IBV216。应用DNAStar分析软件的Clustal W将克隆到的IBV34以及IBV216毒株S1基因分别与Gen Bank中国内外IBV参考毒株的S1基因进行序列比较和同源性分析发现IBV34以及IBV216毒株均属于QX型IBV。IBV34以及IBV 216毒株的S1基因与QX型的LX4毒株同源性分别高达95.5%以及95.4%。值得注意的是,与IBV34毒株以及Gen Bank中其它国内外IBV的S1基因不同,IBV 216毒株的S1基因缺了 12个碱基。从IBV免疫鸡群分离鉴定出的IBV34以及IBV 216毒株对进一步探究IBV免疫逃逸机制提供了材料。2、两株鸡传染性支气管炎病毒的全基因组测序与分析为进一步分析从从IBV免疫鸡群分离鉴定出的IBV34以及IBV 216毒株可能存在的变异以及重组现象。本研究利用21对引物,通过PCR扩增,TA克隆以及序列测序对分离株IBV34及IBV216的全基因组进行了解析。结果发现分离株IBV34以及IBV216全基因组全长分别为27647bp与27654bp（不包括5’端帽子和3’端polyA尾巴）。基因组结构符合IBV的基因组基本特征。IBV34以及IBV 216毒株的全基因组序列与QX型的YXI0毒株的全基因组序列同源性分别高达96.6%以及96.7%。重组事件分析进一步发现,IBV34毒株基因组中鉴定出2个重组事件。分别位于IBV 34基因组5567-8121片段、8672-11925片段。IBV216毒株基因组中同样鉴定出2个重组事件。分别位于5564-7886片段、8402-11923片段。重组来源分析显示IBV34和IBV216来源于QX型与TC07-2型基因型IBV重组。3、两株鸡传染性支气管炎病毒S1基因的克隆为进一步探究这两株来自IBV免疫鸡群的IBV毒株的S1蛋白的抗原性。本研究将IBV34以及IBV 216毒株的S1基因分别克隆至线性化载体pGEX-6p-I和pcDNA3.1上。成功构建了 S1原核表达载体pGEX-6P-1-IBV34-S1、pGEX-6P-1-IBV216-S1及真核表达载体 pcDNA3.1-IBV34-S1、pcDNA3.1-IBV216-SI。将重组子 pGEX-6P-1-IBV34-S1、pGEX-6P-I-IBV216-S1分别转化至BL-21感受态中。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现GST-S1蛋白不仅可以以包涵体形式表达,而且还可以以可溶性形式表达。利用抗QX型IBV血清对真核表达载体pcDNA3.1-IBV34-S1以及pcDNA3.1-IBV216-S1的表达进行了验证。结果发现,所用的抗QX型IBV血清能很好的识别转染pcDNA3.1-IBV34-S1的LMH细胞。可见亮绿色荧光;而在转染pcDNA3.1-IBV216-S1的LMH细胞以及转染对照载体pcDNA3.1的DF-1细胞中未见亮绿色特异性荧光。这一结果提示IBV216毒株S1蛋白中缺失的4个氨基酸（62-65aa）可能影响S1蛋白的抗原性以及血清的免疫反应性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 文献综述
•   第一节 鸡传染性支气管炎病毒研究进展
•     1.1 鸡传染性支气管炎病毒概况
•     1.2 IBV病毒的形态结构与理化特性
•     1.3 IBV的流行病学
•     1.4 IBV的致病性
•     1.5 IBV主要蛋白及其功能
•       1.5.1 S蛋白
•       1.5.2 M蛋白
•       1.5.3 N蛋白
•       1.5.4 E蛋白
•       1.5.5 非结构蛋白
•     1.6 IBV的变异与重组
•     1.7 IBV分型
•     1.8 IBV的免疫防控
•       1.8.1 弱毒疫苗
•       1.8.2 灭活疫苗
•       1.8.3 核酸疫苗
•   第二节 研究目的及意义
• 研究内容一 两株鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定
•   1 材料
•     1.1 主要试验材料
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要试剂的配制
•     1.4 主要仪器
•   2 方法
•     2.1 病毒的繁殖
•     2.2 引物的设计
•     2.3 病毒RNA的提取
•     2.4 cDNA的制备
•     2.5 目的片段的扩增
•     2.6 PCR纯化产物的连接和转化
•     2.7 连接反应产物转化涂板
•     2.8 菌落PCR鉴定
•   3. 结果
•     3.1 病毒鸡胚接种结果
•     3.2 两株IBV病毒与20株IBV参考毒株S1基因序列比较
•   4 讨论
• 研究内容二 两株鸡传染性支气管炎病毒的全基因组测序与分析
•   1 材料
•     1.1 主要试验材料
•     1.2 主要材料
•     1.3 主要仪器
•     1.4主要仪器
•   2 方法
•     2.1 病毒的增殖
•     2.2 引物的设计
•     2.3 病毒RNA的提取
•     2.4 cDNA的制备
•     2.5 目的片段的扩增
•     2.6 PCR纯化产物的连接和转化
•     2.7 连接反应产物转化涂板
•     2.8 全基因组测序分析
•   3 结果
•     3.1 IBV34与IBV216两株病毒各个基因片段扩增结果
•     3.2 IBV34和IBV216毒株全基因组结构
•     3.3 分离株IBV 34基因组的同源重组分析
•     3.4 分离株IBV216基因组的同源重组分析
•   4 讨论
• 研究内容三 两株鸡传染性支气管炎病毒S1基因的克隆表达
•   1 材料
•     1.1 主要试验材料
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要试剂
•     1.4 主要仪器
•   2. 方法
•     2.1 引物设计与合成
•     2.2 RNA的提取
•     2.3 cDNA的制备
•     2.4 目的片段的扩增
•     2.5 RT-PCR产物的胶回收
•     2.6 重组质粒的构建
•     2.7 重组质粒的鉴定
•     2.8 重组蛋白的诱导表达及鉴定
•   3 结果
•     3.1 两株IBV病毒S1基因片段的扩增及重组子构建
•     3.2 重组蛋白GST-S1表达的SDS-PAGE鉴定
•     3.3 重组蛋白GST-S1表达的Western-blot鉴定
•     3.4 间接免疫荧光鉴定S1蛋白真核表达
•   4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张琳婧

导师: 叶建强,张建军

关键词: 免疫鸡群,毒株分离,全基因组测序,基因克隆

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 江苏省“双创团队”项目,江苏省第五期“333工程”项目

分类号: S852.65

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.001424

总页数: 74

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