植物乳杆菌ZDY2013拮抗食源性致病蜡样芽孢杆菌的研究

论文摘要

乳酸菌被广泛应用于乳制品、传统发酵食品以及益生菌产品中,其与肠道菌群的相互作用是国内外研究的热点。在高效选育过程中乳酸菌与病原微生物竞争成为优势菌是应用的前提。本论文在构建产毒素蜡样芽孢杆菌识别方法的基础上,以植物乳杆菌ZDY2013为研究对象,从多角度探究其拮抗食源性致病蜡样芽孢杆菌的作用。全文分为六个章节。第一章绪论对食源致病菌的危害、蜡样芽孢杆菌的毒性、乳酸菌的功能及乳酸菌与食源致病菌的相互作用机制进行了分述,并对植物乳杆菌及其胞外多糖的功能进行了概述。第二章建立了识别复杂食品基质中产毒素蜡样芽孢杆菌的特异性方法。针对蜡样芽孢杆菌特异性序列设计了引物,并构建了选择性识别产呕吐毒素和产肠毒素蜡样芽孢杆菌的复合扩增体系;采用叠氮溴化丙锭(PMA)对样品中细胞膜热破损细胞进行交联处理,再提取基因组DNA用于后续分析;采用多种食品基质、杂菌和死菌作为干扰因素考察复合扩增方法的准确性。结果表明,优化后的复合扩增体系能特异性识别产呕吐毒素和产肠毒素的蜡样芽孢杆菌,适用于淀粉类和乳制品等复杂食品基质的分析;食品基质中复杂菌群不影响该方法对目标DNA的信号获取,且无细胞活力的蜡样芽孢杆菌的DNA信号能够被有效消除;复杂食品基质中的产呕吐毒素菌株的最低检测限是10~3 cfu/g,而低浓度的产肠毒素蜡样芽孢杆菌(10~1 cfu/g)经过短暂增菌也能被特异性识别。第三章探究了植物乳杆菌ZDY2013拮抗产肠毒素蜡样芽孢杆菌的作用方式。利用体外试验确定产肠毒素蜡样芽孢杆菌ATCC14579和HN001受抑制与植物乳杆菌培养液pH的相关性;利用植物乳杆菌与产肠毒素蜡样芽孢杆菌在牛奶中共同培养,探索酸奶发酵中优势菌如何形成;利用小肠上皮细胞模型,研究植物乳杆菌通过不同的粘附定植方式,阻止产肠毒素蜡样芽孢杆菌粘附效果;利用细胞外乳酸脱氢酶活性指示产毒素蜡样芽孢杆菌毒素对细胞的毒害,以及从细胞相关基因应激过表达方面,研究植物乳杆菌对上皮细胞的保护作用。结果表明,产肠毒素蜡样芽孢杆菌在体外生长被抑制是植物乳杆菌产酸所致;在牛奶中共同发酵pH值不断降低,蜡样芽孢杆菌的数量在24 h后也随之下降,而植物乳杆菌不受pH降低的影响;植物乳杆菌能够通过排斥、竞争和替换的方式在小肠上皮细胞上抑制产毒素蜡样芽孢杆菌的粘附定植,且以竞争粘附位点为主;产毒素蜡样芽孢杆菌的培养上清具有破坏上皮细胞结构并诱导乳酸脱氢酶释放的毒性,植物乳杆菌能保护上皮细胞,应对产毒素蜡样芽孢杆菌培养上清导致的相关基因应激过表达。第四章探究了植物乳杆菌发酵奶干预产毒素蜡样芽孢杆菌对小鼠造成的毒副作用。第一组小鼠先灌胃产毒素蜡样芽孢杆菌再灌胃PBS缓冲液;第二组先灌胃植物乳杆菌发酵牛奶再灌胃产毒素蜡样芽孢杆菌;第三组先灌胃产毒素蜡样芽孢杆菌再灌胃植物乳杆菌发酵牛奶;第四组为对照组只灌胃PBS缓冲液。通过监测小鼠体重指数变化,确定产毒素蜡样芽孢杆菌和植物乳杆菌发酵牛奶对小鼠的直接影响;通过测定小鼠血清中炎症因子的水平以及生理生化指标变化,探究产毒素蜡样芽孢杆菌对小鼠健康的干扰作用,以及灌胃植物乳杆菌发酵牛奶是否对其有改善作用;通过16S rDNA高通量测序,分析产毒素蜡样芽孢杆菌是否扰乱肠道菌群平衡,以及植物乳杆菌发酵牛奶是否有利于其恢复。结果表明,产毒素蜡样芽孢杆菌会导致小鼠体重增长放缓甚至降低,也会造成相关炎症因子水平异常;植物乳杆菌发酵牛奶能阻止产毒素蜡样芽孢杆菌导致全血中血小板数和血清中尿酸的升高,同时能够减轻盲肠病理组织的损伤程度;产毒素蜡样芽孢杆菌在不显著性改变小鼠肠道菌群整体结构的基础上,能导致部分菌群的丰度发生改变,而植物乳杆菌发酵牛奶能够缓和这种改变。第五章探究了植物乳杆菌胞外多糖拮抗产毒素蜡样芽孢杆菌的特点。对胞外多糖进行提取、纯化,研究与其生物活性相关的分子量和单糖组分特征;采用磺化处理的方式对其进行性能改良,并表征其功能基团;比较胞外多糖及其衍生物对多种自由基的清除能力,研究磺化处理对胞外多糖生物学活性的改变;利用小肠上皮细胞为模型,探索产不同肠毒素类型(一种、两种或三种)蜡样芽孢杆菌对细胞活性的破坏,以及胞外多糖或者其衍生物的存在对细胞活性的保护作用。结果表明,植物乳杆菌胞外多糖的产量达429.4±30.0 mg/L、纯度为96.06%;空间排阻色谱洗脱曲线证明胞外多糖只有一个峰,分子量为5.17×10~4 Da;气相色谱图表明胞外多糖只由木糖和半乳糖组成,且半乳糖占总含量的98.3%;胞外多糖经过衍生化处理后,抗氧化活性明显提高,随之也增强抵抗产毒蜡样芽孢杆菌培养上清对小肠上皮细胞活性损伤的能力。第六章对植物乳杆菌拮抗食源性致病蜡样芽孢杆菌的生物学功能及其初步机制进行了总结,并对未来研究工作进行了展望。综上所述,本文探究了益生植物乳杆菌与食源性致病蜡样芽孢杆菌的相互作用,从体外、食品、细胞、小鼠以及代谢产物等层面解释了植物乳杆菌拮抗产毒素蜡样芽孢杆菌的现象,加深了乳酸菌与病原微生物互相作用研究的认识,也为植物乳杆菌及其代谢产物在食品工业的开发应用提供了实验依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语索引
• 第1章 绪论
•   1.1 蜡样芽孢杆菌的致病性
•     1.1.1 蜡样芽孢杆菌在食品中的污染现状
•     1.1.2 蜡样芽孢杆菌毒素特征
•     1.1.3 蜡样芽孢杆菌的粘附定植
•     1.1.4 蜡样芽孢杆菌呕吐毒素致毒机制
•     1.1.5 蜡样芽孢杆菌肠毒素致毒机制
•     1.1.6 蜡样芽孢杆菌食物中毒的预防
•     1.1.7 蜡样芽孢杆菌对有机酸的敏感性
•   1.2 乳酸菌的益生性
•     1.2.1 乳酸菌的功能
•     1.2.2 乳酸菌在乳制品中的应用
•     1.2.3 乳酸菌应用于食品的选择标准
•     1.2.4 乳酸菌与病原微生物相互作用
•   1.3 植物乳杆菌的研究进展
•     1.3.1 植物乳杆菌的分离源
•     1.3.2 植物乳杆菌的益生功能
•     1.3.3 植物乳杆菌胞外多糖的生物活性
•     1.3.4 植物乳杆菌胞外多糖的应用
•   1.4 参考文献
• 第2章 复杂食品基质中产毒素蜡样芽孢杆菌的灵敏识别
•   2.1 前言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 实验菌株
•     2.2.2 主要实验试剂
•     2.2.3 主要仪器设备
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 特异性引物的获取
•     2.3.2 失活细胞的获取以及DNA的提取
•     2.3.3 叠氮溴化丙锭的使用
•     2.3.4 复合扩增体系及条件
•     2.3.5 复杂食品基质对复合扩增的影响
•     2.3.6 环境样品中复杂菌群和失活细胞对复合扩增的影响
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 复合扩增的引物特异性分析
•     2.4.2 构建的复合扩增体系适用于纯培养中细菌的识别
•     2.4.3 模拟食品基质中细胞完整的蜡样芽孢杆菌的识别
•     2.4.4 食品基质中复杂菌群对复合扩增信号的干扰
•   2.5 结果分析与讨论
•   2.6 参考文献
• 第3章 植物乳杆菌体外拮抗产毒素蜡样芽孢杆菌的研究
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 实验菌株及细胞
•     3.2.2 主要实验试剂
•     3.2.3 主要仪器设备
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 细菌悬浮液的制备
•     3.3.2 植物乳杆菌体外抑制产毒素蜡样芽孢杆菌
•     3.3.3 模拟植物乳杆菌与产毒素蜡样芽孢杆菌在牛奶样品中共发酵
•     3.3.4 植物乳杆菌抑制产毒素蜡样芽孢杆菌对肠上皮细胞的粘附
•     3.3.5 植物乳杆菌对产毒素蜡样芽孢杆菌诱导肠上皮细胞产生乳酸脱氢酶的影响
•     3.3.6 植物乳杆菌缓解产毒素蜡样芽孢杆菌诱导细胞相关基因过表达
•   3.4 实验结果
•     3.4.1 产毒素蜡样芽孢杆菌对植物乳杆菌不同pH上清的敏感性
•     3.4.2 植物乳杆菌在牛奶中以共同发酵模式拮抗产毒素蜡样芽孢杆菌
•     3.4.3 植物乳杆菌在肠上皮细胞水平上拮抗产毒素蜡样芽孢杆菌
•     3.4.4 植物乳杆菌在肠上皮细胞释放乳酸脱氢酶上对蜡样芽孢杆菌的影响
•     3.4.5 植物乳杆菌阻止产毒素蜡样芽孢杆菌导致的上皮细胞中基因过表达
•   3.5 结果分析与讨论
•   3.6 参考文献
• 第4章 植物乳杆菌拮抗产毒素蜡样芽孢杆菌对小鼠肠道菌群的影响
•   4.1 前言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 实验菌株
•     4.2.2 主要实验试剂
•     4.2.3 主要仪器设备
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 细菌悬液的获取
•     4.3.2 植物乳杆菌发酵牛奶的制备
•     4.3.3 小鼠实验设计
•     4.3.4 小鼠全血和血清生理生化分析
•     4.3.5 不同组别小鼠血清炎症因子水平
•     4.3.6 小鼠盲肠组织H&E染色
•     4.3.7 小鼠肠道菌群16SrDNA测序
•   4.4 实验结果
•     4.4.1 植物乳杆菌发酵奶和产毒素蜡样芽孢杆菌对小鼠体重的影响
•     4.4.2 产毒素蜡样芽孢杆菌对小鼠血清炎症因子水平的影响
•     4.4.3 产毒素蜡样芽孢杆菌对小鼠血液生理生化指标的影响
•     4.4.4 植物乳杆菌发酵奶改善损伤的小鼠肠粘膜结构
•     4.4.5 Illumina高通量测序识别小鼠肠道微生物的变化
•   4.5 结果分析与讨论
•   4.6 参考文献
• 第5章 植物乳杆菌胞外多糖及其衍生物的生物学活性研究
•   5.1 前言
•   5.2 实验材料
•     5.2.1 实验菌株及细胞
•     5.2.2 主要实验试剂
•     5.2.3 主要仪器设备
•   5.3 实验方法
•     5.3.1 细菌培养上清的制备
•     5.3.2 植物乳杆菌胞外多糖提取与纯化
•     5.3.3 植物乳杆菌胞外多糖的紫外扫描光谱及其纯度
•     5.3.4 植物乳杆菌胞外多糖的分子量测定
•     5.3.5 植物乳杆菌胞外多糖的单糖组分分析
•     5.3.6 植物乳杆菌胞外多糖的衍生化及其红外光谱分析
•     5.3.7 植物乳杆菌胞外多糖及其衍生物的抗氧化活性
•     5.3.8 植物乳杆菌胞外多糖及其磺化产物拮抗产毒素蜡样芽孢杆菌的细胞毒性
•   5.4 实验结果
•     5.4.1 植物乳杆菌胞外多糖的纯度及产量
•     5.4.2 植物乳杆菌胞外多糖的分子量及其单糖组分
•     5.4.3 植物乳杆菌胞外多糖及其衍生物的红外光谱及主要官能团
•     5.4.4 植物乳杆菌胞外多糖及其衍生物的抗氧化活性
•     5.4.5 植物乳杆菌胞外多糖存在条件下产毒素蜡样芽孢杆菌的细胞毒性
•     5.4.6 植物乳杆菌胞外多糖及其衍生物拮抗产毒蜡样芽孢杆菌的细胞毒性
•   5.5 结果分析与讨论
•   5.6 参考文献
• 第6章 结论与展望
•   6.1 结论
•     6.1.1 基于蜡样芽孢杆菌毒素基因构建的方法可用于复杂食品体系
•     6.1.2 植物乳杆菌与产毒素蜡样芽孢杆菌在体外互作成为优势菌群
•     6.1.3 植物乳杆菌干预蜡样芽孢杆菌对小鼠的损伤和肠道菌群影响
•     6.1.4 植物乳杆菌代谢产物的活性改良及抵抗蜡样芽孢杆菌的细胞毒性
•   6.2 展望
• 致谢
• 攻读学位期间的成果
• 个人简介

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张志鸿

导师: 魏华,许恒毅

关键词: 植物乳杆菌,蜡样芽孢杆菌,肠毒素,共同发酵,粘附,肠道微生物,胞外多糖,生物活性

来源: 南昌大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 南昌大学

分类号: TS201.3

总页数: 152

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