焦晨淤JIAOChen曰夏甜于XIATian（淤内蒙古化工职业学院材料工程系，呼和浩特010070；于内蒙古化工职业学院思政理论教研部，呼和浩特010070）（淤DepartmentofMaterialsEngineering，InnerMongoliaVocationalCollegeofChemicalEngineering，Hohhot010070，China；于IdeologicalandPoliticalTheoryTeachingandResearchDepartment，InnerMongoliaVocationalCollegeofChemicalEngineering，Hohhot010070，China）
摘要院本课题拟使用基于16SrDNA的PCR-DGGE技术，对哈拉沁沟水库微生物的多样性进行分析和研究。对于进一步了解哈拉沁沟水库微生物的多样性、分布特性以及开展水体生态系统监测具有比较重要的意义。
Abstract院BasedonthePCR-DGGEtechnologyof16SrDNA,thispaperanalysesandstudiesthemicrobialpersityofHalaqinreservoir,whichisimportantforfurtherunderstandingthemicrobialpersity,distributioncharacteristics,andcarringoutwaterecosystemmonitoringoftheHalaqinreservoir.关键词院哈拉沁沟；微生物多样性；DGGE；16SrDNAKeywords院Halaqinditch；microbialpersity；DGGE；16SrDNA中图分类号院X176文献标识码院A文章编号院1006-4311（2014）27-0324-02
1研究区概况哈拉沁沟位于呼和浩特市正北，是呼和浩特市境内最大的一条山洪沟，沟长58公里，流域面积709平方公里，年径流量2262万立方米。沟中流水常年不断，源于武川县北黄花窝铺村西南2公里，武川境内称东河。河水由北向南顺哈拉沁沟流出，经哈拉沁、毫沁营、如意河村东，在讨号板村东汇入小黑河，沟外河道全长58公里，是小黑河的主要支流。
2实验流程和研究方法2.1实验流程将PCR-DGGE技术应用于微生物多样性分析的基本流程如下：分析样品———提取DNA———PCR———DGGE———直接对带谱进行分析（或对条带进行测序及分析系统发育）。
2.2研究方法淤水体样品采集及样品的前期处理。
于提取水体微生物基因组DNA。
盂水体微生物粗提基因组DNA的纯化[1]。
榆PCR扩增技术。
虞PCR产物检测。
愚PCR产物的纯化过程。
舆DGGE电泳。
3综合实验结果与分析3.1水体理化性质1号2号水体样品采集地点位于研究水域中央区域采集纵断面相同，水体略发淡绿色，水面受到较强阳光直射，部分枯树叶漂浮于水面，其中：1号采样点位于水面下10cm位置，2号采样点位于水面下50cm位置，水温均为33益；3号4号采集地点位于研究水域西岸采集纵断面相同，采集地点水域漂浮较多枯树叶，周围树木生长较为密集，水面基本无较强阳光直射，其中：3号采样点位于水面下10cm位置，4号采样点位于水面下50cm位置，水温均为28益；5号6号采集地点位于研究水域东岸采集纵断面相同，水面漂浮有较多枯树叶、杂草及部门生活垃圾，周围树木生长较为密集，水面有一定阳光直射，其中：5号采样点位于水面下10cm位置，6号采样点位于水面下50cm位置，水温均为30益。
研究结果表明，虽然取样深度位置有所不同，但其水样PH值基本无大的变化，水体温度也基本相同，研究区域水体在PH值及水温指标方面具备一致性特点。
3.2粗提和纯化提取的DNA样品电泳图谱比较通过观察粗提和纯化提取的DNA样品电泳图谱发现水体微生物粗提基因组DNA条带对应的电泳图像呈现一定程度的拖尾现象，这表明研究样品含有较高量的RNA或者蛋白类杂质物质，且仅经过粗提所获得的基因组DNA浓度相对偏低。
水体微生物粗提基因组DNA的纯化总DNA条带无明显拖尾且条带单一，基因组DNA浓度较粗提有所升高，可直接应用于PCR扩增。部分样品可能受到重金属物质或者水体中有机物质的干扰影响，虽多次提取，但仍未见任何效果，最终被迫放弃。
3.3不同引物PCR效果比较16SrDNAV3和V6V9区PCR结果：采用上述试验中经过纯化的DNA为模板，使用16SrDNA的V3区通用引物和V6V9区通用引物分别对其进行扩增[2]，其扩增结果显示V6V9区较V3区扩增效果要好，其DNA的扩增电泳结果图像比较清晰，可以进一步做DGGE分析。
3.4DGGE凝胶电泳图谱由图1V6V9PCR产物回收后的DGGE图谱可得，1号样品可以观测到7条电泳图条带，表明该研究样品中包含7种以上菌体，2号样品中理论上应该包含4种以上菌体，3号样品中包含6种以上菌体，4号中包含8种以上菌体。
结果表明，处于不同位置上的样品在微生物的组成上表现出较为明显的差异性，其优势菌群所代表的电泳图条带无论从位置还是数量方面都呈现出较为明显的变化，研究样品中菌体组成在诸多方面均受到环境因子差异性的影响，表征出不同样品之间由于菌体基因组成的差异性及遗传的多样性[3]，表1为DGGE电泳图条带分布情况结果统计。
4小结4.1湖泊水体系中微生物菌群群落多样性的PCR原DGGE分析方法淤DNA提取纯化方法：将采用PS法提取基因组DNA与柱式法纯化相结合所得到的DNA样品应用于PCR扩增时产生的试验效果较为理想。
于两种聚合酶PCR扩增过程效果都比较理想，通过DGGE电泳检测得出，LATaq得到的电泳图条带显示位置和明亮度较为接近；pfu电泳图条带显示位置和明亮度相对较弱。
综合试验过程中各种因素对结果的影响，拟确定采用以下的分析方案：PS法提取基因组DNA———柱式法纯化———LATaq聚合酶PCR扩增———DGGE电泳过程中变性剂浓度范围20豫原80豫、60益、160V恒定电压电泳8h———快速银染法染色。
4.2呼和浩特哈拉沁沟水库水体某断面的细菌多样性分析结果，可以得出：1，2号水体样品采集地点处于同一垂直位置，表明研究水体采样地点的菌类数量上层较下层多，其中上层与下层的共有菌种与有四种，且上层较之下层多具有三种菌类。1，2号采样点位于水体中间同一纵断面处，表明此类水域中好氧类菌体相对厌氧类菌体和兼性厌氧类菌体在数量上占优势。3，4号采样点位于同一纵断面，表明此类水域中厌氧类菌体和兼性厌氧类菌体较好氧类菌体数量占优势，这可能是由于采样位置距离附近的污水排水管道较近导致。1，3号采样点位于同一水平位置，但3号采样点距离附近污水排水管道较近，导致菌体生长略差菌体数量偏少。2，4号采样点位于同一水平位置，但由于4号采样位置受到附近污水排放物质影响，4号采样点菌体数量较2号采样点多。DGGE电泳图条带共得到8个条带，可见其垂直方向与水平方向均呈现较为明显的细菌种类重叠性，条带数量多少与水体污染程度呈现正比例关系。
参考文献院[1]张瑞福，曹慧，崔中利等.土壤微生物总DNA的提取和纯化[J].微生物学报，2003，43（2）：274-285.[2]罗海峰，齐鸿雁，薛凯等.在PCR-DGGE研究土壤微生物多样性中应用GC发卡结构的效应[J].生态学报，2003，23（10）：2168-2174.[3]刑德峰，任南琪.应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析[J].微生物学报，2006，46（2）：330-337.