调控水稻磷吸收基因OsRLK2的图位克隆与功能研究

论文摘要

磷是植物生长与发育过程所必须的大量元素之一,在植物体内具有重要作用。磷在植物生长发育过程中,参与物质合成,能量转化,信号传递等一系列的过程。土壤对磷的固定作用导致土壤中可溶性磷的浓度非常低,因此植物对磷的吸收利用效率也非常低。植物对磷的吸收和转运主要依靠植物体内的磷转运蛋白,因此磷转运蛋白在维持植物体内磷平衡和正常发育的过程中起重要作用。通过筛选本实验室水稻T-DNA插入突变体库,我们得到了一个磷积累,部分叶尖坏死,植株矮化的突变体,并将其命名为rlk2。突变体rlk2以粳稻品种日本晴（Nipponbare）为遗传背景,在幼水稻幼苗期突变体与野生型叶片中有效磷含量无显著差异,水稻进入分蘖期后突变体叶片中有效磷含量显著高于野生型,且植株矮化,叶尖坏死等表型逐渐显现。通过构建遗传群体和田间表型的统计实验得出rlk2突变为隐性纯合突变。通过构建定位群体和运用图位克隆技术,我们从水稻基因组中克隆了一个编码水稻类受体蛋白激酶的基因,将其命名为OsRLK2。OsRLK2在地下组织和地上组织中都有表达。类受体蛋白激酶在植物体中是一个非常重要的信号调节因子。类受体蛋白激酶的结构主要包括一个胞外受体域,一个跨膜域和一个胞内蛋白激酶域。亚细胞定位实验表明OsRLK2蛋白定位在细胞质膜上。通过酵母筛选实验,我们获得了一个和OsRLK2互作的磷转运蛋白OsPT8。进一步的实验证明OsRLK2和OsPT8之间能够相互作用。OsPT8作为高亲和性磷转运蛋白,在水稻各组织中均有表达,是影响水稻磷吸收与转运的重要转运蛋白。通过体外磷酸化实验发现OsRLK2对OsPT8具有翻译后修饰作用,OsRLK2可能通过对OsPT8的磷酸化修饰,调控OsPT8对磷的吸收与转运。本实验初步阐述了类受体激酶OsRLK2调控磷吸收和转运的分子机制,对提高水稻磷的利用效率,维持水稻体内磷的平衡具有重要的意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 受体激酶
•     1.1.1 植物类受体蛋白激酶的特征与分类
•     1.1.2 植物类受体蛋白激酶的生理功能
•   1.2 磷转运蛋白
•     1.2.1 Pht1家族蛋白
•     1.2.2 Pht2、Pht3、Pht4家族蛋白分生组织
•   1.3 植物体内磷平衡
•     1.3.1 植物对磷素的吸收及运输
•     1.3.2 植物响应磷素胁迫信号的分子机制
•   1.4 本研究的意义
• 第二章 水稻突变体rlk2表型观察与生理分析
•   2.1 实验材料
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 水稻种植与表型观察
•     2.2.2 rlk2大量元素及部分微量元素测定
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 突变体筛选与表型分析
•     2.3.2 突变体与野生型各营养元素含量比较
•   2.4 讨论
• 第三章 水稻突变体的遗传分析与基因克隆
•   3.1 实验材料
•   3.2 实验试剂与耗材
•   3.3 实验仪器
•   3.4 试验方法
•     3.4.1 遗传分析
•     3.4.2 F2代定位群体构建
•     3.4.3 提取水稻的基因组DNA
•     3.4.4 PCR扩增体系
•     3.4.5 琼脂糖凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳
•     3.4.6 设计分子标记
•     3.4.7 突变基因定位方法
•   3.5 结果与分析
•     3.5.1 突变体rlk2的遗传分析
•     3.5.2 分子标记
•     3.5.3 初定位与精细定位
•     3.5.4 rlk2突变体突变位点分析
•   3.6 讨论
• 第四章 OsRLK2基因功能互补验证
•   4.1 实验材料
•   4.2 实验试剂与耗材
•   4.3 实验仪器
•   4.4 实验方法
•     4.4.1 从水稻中进行RNA的提取
•     4.4.2 RNA逆转录为cDNA
•     4.4.3 引物设计
•     4.4.4 PCR扩增体系
•     4.4.5 目的片段回收
•     4.4.6 目的片段与空载体的酶切回收
•     4.4.7 载体骨架与目的片段的连接转化
•     4.4.8 新构载体的鉴定与质粒提取
•     4.4.9 互补载体转化农杆菌
•     4.4.10 农杆菌侵染突变体愈伤组织
•     4.4.11 对转基因植株基因型及表型鉴定
•   4.5 结果与分析
•     4.5.1 水稻总RNA提取
•     4.5.2 互补载体p23A-RLK2的重新构建
•     4.5.3 重组质粒转化农杆菌检测
•     4.5.4 转基因阳性植株检测
•     4.5.5 互补表型鉴定
•   4.6 讨论
• 第五章 OsRLK2蛋白的亚细胞定位
•   5.1 实验材料
•   5.2 实验试剂与耗材
•   5.3 实验仪器
•   5.4 实验方法
•     5.4.1 pAN580-RLK2-GFP载体构建
•     5.4.2 pAN580-RLK2-GFP质粒提取
•     5.4.3 制备水稻原生质体
•     5.4.4 PEG介导转化水稻原生质体
•     5.4.5 激光共聚焦扫描显微镜观察水稻原生质体
•   5.5 结果与分析
•     5.5.1 构建pAN580-RLK2-GFP载体
•     5.5.2 观察OsRLK2蛋白在水稻原生质体中的定位
•   5.6 讨论
• 第六章 OsRLK2功能研究
•   6.1 实验材料
•   6.2 实验试剂与耗材
•   6.3 实验仪器
•   6.4 实验方法
•     6.4.1 诱饵载体pGBKT7-RLK2构建
•     6.4.2 将诱饵载体pGBKT7-RLK2进行酵母转化
•     6.4.3 诱饵基因载体筛库
•     6.4.4 候选基因酵母双杂验证
•     6.4.5 OsRLK2激酶域-His融合载体与OsPT8胞内域-GST融合载体的构建
•     6.4.6 目的蛋白的纯化
•     6.4.7 体外磷酸化与去磷酸化实验
•   6.5 结果与分析
•     6.5.1 互作蛋白基因筛选
•     6.5.2 OsPT8与OsRLK2互作蛋白基因点对点验证
•     6.5.3 磷酸化实验结果
•   6.6 讨论
• 第七章 全文结论
•   7.1 结论
•   7.2 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 邢豹

导师: 韩霄

关键词: 水稻,类受体激酶,磷转运蛋白,磷酸化修饰,磷平衡

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学,生物学

单位: 中国农业科学院

分类号: Q943.2;Q945

总页数: 54

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