嗜热四膜虫胱硫醚-γ-裂解酶Cgl1的表达、定位及功能分析

论文摘要

含硫氨基酸在不同的生物体中具有重要生物学功能,是一类功能性氨基酸,参与机体的功能调控,在DNA和蛋白质的修饰、细胞的免疫应答和氧化还原反应等过程中发挥作用。转硫途径是细胞内代谢的核心途径,因此,精确控制直接参与合成含硫氨基酸的转硫途径对于维持正常细胞功能至关重要。嗜热四膜虫是一种重要的单细胞模式生物,具有灵敏的环境响应机制和精细的细胞代谢途径。然而其细胞内转硫代谢途径并不清楚。本研究首次研究了嗜热四膜虫中转硫途径关键酶胱硫醚-γ-裂解酶,对其重组表达,活性分析和细胞内功能进行了系统分析,获得主要结果如下:1.嗜热四膜虫中胱硫醚-γ-裂解酶的酶活鉴定通过生物信息学分析,鉴定了嗜热四膜虫进化上保守的胱硫醚-γ-裂解酶基因（cystathionineγ-lyase 1,CGL1,TTHERM00052400）,开放阅读框1230 bp,编码409个氨基酸。在生长期高水平表达,而在饥饿期和有性生殖期维持在较低的表达水平。体外人工合成CGL1基因,构建重组表达质粒pGST-CGL1,转化大肠杆菌BL21（DE3）表达重组蛋白,亲和层析获得纯化的GST-Cgl1。酶活分析表明GST-Cgl1可以裂解胱硫醚产生半胱氨酸,裂解半胱氨酸和同型半胱氨酸产生H2S。在45℃以内相对酶活维持在70%以上;在45℃以后酶活力急剧下降。最适pH为8.0;在pH7.0左右较稳定,在偏酸或偏碱的条件下,均不稳定;当pH高于9.0之后,相对酶活不到10%。2.Cgl1定位于嗜热四膜虫细胞质和细胞核中构建重组质粒pNEO4-3HA-CGL1和pXS75-CGL1,分别转化四膜虫,获得融合了HA标签的突变株。免疫荧光定位表明,HA-Cgl1在营养生殖期定位在大核;饥饿期定位在细胞质;有性生殖前期定位在亲本大核,而在后期定位在细胞质中。当CGL1过表达后,HA-Cgl1在营养生殖期定位于小核和大核,并在核膜有富集;在有性生殖anlagen期之前定位于生殖小核、功能大核和细胞质,anlagen时期后新小核与亲本大核上出现明显定位。3.CGL1的过量表达抑制细胞增殖和有性生殖通过Cd2+离子诱导,CGL1过量表达。当CGL1过量表达,抑制细胞的增殖。有性生殖时期,过表达突变株小核异常分裂,导致细胞无法完成有性生殖过程,表明该基因可能参与细胞中DNA复制等过程。4.CGL1的敲减影响有性生殖过程中细胞核的稳定性为进一步研究CGL1的功能,构建敲除质粒pNEO4-KO-CGL1,转化四膜虫,通过抗性筛选和表型分配,无法获得稳定的CGL1敲除株,表明CGL1对细胞的增殖是必需的。因此,我们构建了诱导型干扰质粒pSMC1hpNEO-CGL1,转化四膜虫,获得CGL1干扰突变株。通过诱导和RNAi干扰,抑制CGL1表达,细胞的增殖降低。有性生殖过程中,CGL1干扰突变株不能正常形成合子核,发育中的小核异常降解,产生仅含有一个大核的单细胞。表明Cgl1参与调控了有性生殖时期功能性小核的形成。总之,本研究从嗜热四膜虫中鉴定出一种胱硫醚-γ-裂解酶基因CGL1。体外表达纯化获得重组蛋白GST-Cgl1。GST-Cgl1可以裂解胱硫醚产生半胱氨酸,裂解半胱氨酸和同型半胱氨酸,产生H2S。Cgl1不仅定位在四膜虫细胞质,而且动态定位在不同的细胞核。CGL1的敲减和过量表达均会影响四膜虫细胞的增殖,CGL1的敲减影响了有性生殖过程中合子核的形成。结果表明嗜热四膜虫中胱硫醚-γ-裂解酶具有不同的底物活性,参与调控营养生长期细胞的增殖;通过对生殖系小核的影响,控制细胞有性生殖进程。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 含硫氨基酸具有重要的生物学功能。
•   1.2 胱硫醚-γ-裂解酶的结构和功能
•   1.3 嗜热四膜虫是研究代谢通路的重要模式生物。
•   1.4 本课题的研究意义
• 第二章 嗜热四膜虫中CGL1的表达纯化和酶学性质分析
•   2.1 材料和试剂
•     2.1.1 细胞株和质粒
•     2.1.2 主要试剂和工具酶
•     2.1.3 引物
•     2.1.4 主要试剂的配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 序列分析比对
•     2.2.2 嗜热四膜虫细胞的培养
•     2.2.3 嗜热四膜虫全基因组的提取
•     2.2.4 嗜热四膜虫总RNA的提取
•     2.2.5 野生型嗜热四膜虫CGL1 基因的克隆
•     2.2.6 构建重组质粒pGST-CGL
•     2.2.7 重组酶表达纯化
•     2.2.8 透析
•     2.2.9 BCA法测定GST-Cgl1 蛋白浓度
•     2.2.10 Western blot
•     2.2.11 酶活检测
•     2.2.12 酶学性质检测
•   2.3 结果
•     2.3.1 CGL1 序列比对
•     2.3.2 代谢通路分析
•     2.3.3 CGL1 基因的鉴定
•     2.3.4 嗜热四膜虫CGL1 基因的合成及pGST-CGL1 的构建鉴定
•     2.3.5 Cgl1 蛋白表达、纯化及Western blot
•     2.3.6 Cgl1 裂解L-胱硫醚产生Cys,同时裂解Cys和 Hcy产生H2S
•     2.3.7 Cgl1 的酶学性质
•   2.4 讨论
• 第三章 CGL1 在嗜热四膜虫中的定位分析
•   3.1 材料和试剂
•     3.1.1 菌株和质粒
•     3.1.2 试剂和工具酶
•     3.1.3 主要实验仪器
•     3.1.4 主要试剂的配制
•     3.1.5 引物
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 四膜虫全基因组的提取
•     3.2.2 四膜虫RNA的提取及反转录成c DNA
•     3.2.3 内源质粒pNEO4-3HA-CGL1 的构建
•     3.2.4 过表达载体pXS75-CGL1 的构建
•     3.2.5 嗜热四膜虫细胞转化
•     3.2.6 四膜虫转化菌株的筛选
•     3.2.7 嗜热四膜虫的配对
•     3.2.8 间接免疫荧光定位
•   3.3 结果
•     3.3.1 pNEO4-3HA-CGL1和pXS75-CGL1 重组质粒的鉴定
•     3.3.2 内源和过表达突变细胞株的筛选、鉴定
•     3.3.3 HA-Cgl1 定位在小核和亲本大核
•     3.3.4 CGL1 过表达影响四膜虫有性生殖
•   3.4 讨论
• 第四章 CGL1 参与嗜热四膜虫增殖调控和有性生殖发育
•   4.1 材料和试剂
•     4.1.1 菌株和质粒
•     4.1.2 试剂与工具酶
•     4.1.3 主要实验仪器
•     4.1.4 主要试剂的配制
•     4.1.5 引物
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 pNEO4-KO-CGL1 敲除重组质粒的构建
•     4.2.2 pSMC1hpNEO-CGL1 干扰重组质粒的构建
•     4.2.3 嗜热四膜虫细胞转化
•     4.2.4 四膜虫转化菌株的筛选
•     4.2.5 实时荧光定量
•     4.2.6 实时荧光定量数据处理
•     4.2.7 嗜热四膜虫的培养、饥饿及配对
•     4.2.8 细胞内H2S含量的检测
•   4.3 结果
•     4.3.1 pNEO4-KO-CGL1 敲除重组质粒的鉴定
•     4.3.2 敲除突变株的筛选与鉴定
•     4.3.3 pSMC1hpNEO-CGL1 干扰重组质粒的鉴定
•     4.3.4 干扰突变株的筛选、鉴定
•     4.3.5 CGL1 影响四膜虫营养生殖
•     4.3.6 CGL1 敲减抑制四膜虫有性生殖
•   4.4 讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 附录Ⅰ
• 附录 Ⅱ
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 韩挺

导师: 王伟

关键词: 嗜热四膜虫,胱硫醚裂解酶,细胞定位,酶活性质

来源: 山西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 山西大学

分类号: Q78;Q55

DOI: 10.27284/d.cnki.gsxiu.2019.000665

总页数: 76

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