类泛素化蛋白NEDD8单克隆抗体制备

论文摘要

利用RT-PCR从A549细胞中扩增出类泛素化蛋白编码的nedd8基因,将其克隆至原核表达载体p ET-30a（+）中,测序验证后转化入BL21（DE3）进行IPTG诱导,表达获得NEDD8蛋白,经纯化后,免疫接种6周龄BALB/c小鼠。细胞融合后,用ELISA和Western blot方法筛选单克隆抗体细胞株。结果成功制备获得3株单克隆抗体。免疫特异性鉴定结果表明,所得到的3株单抗适用于Co-IP试验,可以特异性检测NEDD8修饰的Cullin-1底物。通过分段表达鉴定单抗针对的抗原表位可能在29RVEE32氨基酸区域,与泛素化蛋白（Ub）无交叉反应。本研究制备的特异性单抗为进一步鉴定NEDDylation修饰底物提供了良好的抗体工具。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 细胞和实验动物
•   1.2 载体与主要试剂
•   1.3 NEDD8 PCR扩增
•   1.4 重组原核表达载体及真核表达载体的构建
•   1.5 NEDD8蛋白原核表达及鉴定
•   1.6 小鼠免疫及抗体制备
•   1.7 间接ELISA方法的建立
•   1.8 SDS-PAGE和Western blot鉴定
•   1.9 免疫共沉淀（Co-immuno-precipitation,Co-IP）
•   1.1 0 NEDD8抗原表位鉴定
• 2 结果
•   2.1 原核重组质粒pET30-Nedd8鉴定
•   2.2 重组蛋白的表达和纯化结果
•   2.3 间接ELISA方法建立
•   2.4 单抗制备
•   2.5 Western blot检测
•   2.6 Co-IP检测结果
•   2.7 NEDD8抗原表位鉴定
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 姚威,孙海伟,霍娜,于婉琪,萧飒,陈鸿军

关键词: 单克隆抗体

来源: 中国动物传染病学报 2019年06期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院上海兽医研究所,西北农林科技大学动物医学院

基金: 国家自然科学基金面上项目资助(31572502)

分类号: S852.4

页码: 83-88

总页数: 6

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