Ar-HP1在卤虫休眠胚胎形成过程中的作用

论文摘要

生活在高山盐湖中的卤虫,为了适应缺氧、干燥、高盐等恶劣条件,进化出了特殊生殖方式。在相对适宜的环境中能够直接产出无节幼体,行卵胎生,而在极端环境下则产出休眠胚胎,行卵生生殖方式。产出的休眠胚胎可以长期保持静止状态,在低温冷冻等条件下才能被激活,重新进入其生命周期,这一现象的具体机理还未完全被阐明。卤虫休眠胚胎中的细胞大多都处在静息状态（Quiescent）,细胞核内高度染色质化。利用这一模型,结合胚胎细胞内异染色质含量高的特点,从异染色质形成的角度去探明卤虫休眠胚胎形成的过程。本研究首先从卤虫转录组数据库中,得到卤虫异染色质蛋白1（Ar-HP1）,通过分子克隆方法进行序列验证,得到其完整序列并进行多物种的比对和进化树分析。利用特异性引物,对卤虫胚胎各个时期的Ar-HP1进行定量分析,发现在Diapause时期存在高表达,同时利用HP1α抗体进行western blotting分析,发现Ar-HP1蛋白在休眠胚胎形成过程中呈现表达量逐渐升高的现象,直到Diapause时期达到最高峰。利用HP1α抗体进行免疫荧光检测,同样发现随休眠胚胎发育过程,Ar-HP1呈逐渐升高的表达模式,同时有从核外向核内定位的趋势。为了验证Ar-HP1对卤虫休眠胚胎形成的作用,利用si RNA显微注射的方法,干涉Ar-HP1的表达,结果显示干涉后出现Ar-HP1在m RNA水平,蛋白表达量上均出现明显下降,伴随着卤虫生殖模式的改变,从卵生休眠胚胎变为直接产出无节幼体。同时干涉后休眠胚胎从免疫荧光检测和电镜观察上都可以得到HP1蛋白表达降低,细胞核内异染色质化程度下降的现象,充分表明异染色质化对卤虫休眠胚胎形成有着重要作用,而Ar-HP1作为卤虫体内异染色质蛋白,在休眠胚胎形成过程中,如果不能顺利完成异染色化,将导致休眠胚胎形成受阻,从而出现卤虫生殖方式的变化。综上所述,我们可以认为Ar-HP1作为卤虫异染色质蛋白,在异染色质形成过程中起到重要作用,其缺失会导致异染色化过程不能完成,而卤虫休眠胚胎的形成伴随着胚胎细胞进入静息状态,需要大量异染色质的形成来维持,故而Ar-HP1在卤虫休眠胚胎形成过程中有着重要作用。本研究的发现,为进一步阐明卤虫休眠机制提供了新的思路和数据证明。

论文目录

• 致谢
• 前言
• 摘要
• Abstract
• 缩写、符号清单、术语表
• 1 引言
•   1.1 研究背景
•     1.1.1 卤虫概况
•     1.1.2 卤虫生殖模式
•     1.1.3 卤虫休眠胚胎
•     1.1.4 异染色质概况
•     1.1.5 异染色质蛋白 1
•   1.2 研究目的与意义
• 2 Ar-HP1基因的分子克隆
•   2.1 引言
•   2.2 材料
•     2.2.1 实验材料
•     2.2.2 主要试剂
•     2.2.3 主要仪器
•   2.3 方法
•     2.3.1 卤虫各组织总RNA的抽提
•     2.3.2 cDNA第一链的合成
•     2.3.3 Ar-HP1 cDNA全序列的分子克隆
•   2.4 结果
•   2.5 小结与讨论
• 3 Ar-HP1的表达特征分析
•   3.1 引言
•   3.2 材料
•     3.2.1 实验材料
•     3.2.2 主要试剂
•     3.2.3 主要仪器
•   3.3 方法
•     3.3.1 卤虫各组织总RNA的抽提
•     3.3.2 Western Blotting
•     3.3.3 Realtime PCR
•   3.4 结果
•   3.5 小结与讨论
• 4 Ar-HP1在胚胎细胞中的定位
•   4.1 引言
•   4.2 材料
•     4.2.1 实验材料
•     4.2.2 主要试剂
•     4.2.3 主要仪器
•   4.3 方法
•     4.3.1 卤虫组织石蜡切片制备
•     4.3.2 卤虫组织抗体检测
•   4.4 结果
•   4.5 小结与讨论
• 5 Ar-HP1在卤虫休眠胚胎形成中的功能分析
•   5.1 引言
•   5.2 材料
•     5.2.1 实验材料
•     5.2.2 主要试剂
•     5.2.3 主要仪器
•   5.3 方法
•     5.3.1 卤虫Ar-HP1 si RNA制备
•     5.3.2 卤虫Ar-HP1 RNA干涉
•     5.3.3 卤虫组织电镜超薄切片制备
•   5.4 结果
•   5.5 小结与讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 附录1 论文中所用引物
• 附录2 常用试剂配制
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张昊

导师: 邱猛生,杨卫军,杨劲树

关键词: 卤虫休眠胚胎,异染色质

来源: 杭州师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 杭州师范大学

分类号: Q95-33

总页数: 50

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