猪流行性腹泻病毒IgG、IgA抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

论文摘要

猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的以呕吐、水样腹泻和脱水为主要症状的急性、高度接触性肠道传染病。自2010年秋以来,PEDV在全国大范围的流行,给我国养猪业带来了巨大的经济损失,对于PEDV的预防,目前主要还是以疫苗免疫为主,然而由于各个养殖场疫苗接种方法的不同、疫苗质量的差异等原因,虽然接种了 PED疫苗,但接种后抗体水平往往参差不齐,因此对于PED疫苗免疫后抗体水平的检测尤为重要。本试验分别以纯化后的PEDV全病毒抗原和重组N蛋白作为包被抗原,建立了能够检测母猪初乳中PEDV IgA抗体和猪血清中PEDV IgG抗体的间接ELISA方法,本研究的内容包括以下部分:1)PEDV纯化全病毒抗原和重组N蛋白抗原的制备首先,将实验室制备保存的pET-28B-N重组质粒转化入E.coli Rosetta（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析初步确定重组蛋白得到了可溶性表达,诱导条件为15℃下加入0.5 mmol/L的IPTG诱导24h,蛋白表达量最高,经BCA法测得重组N蛋白的浓度为1.23 mg/mL,表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PEDV标准阳性血清发生特异性反应。其次,收集PEDV细胞培养液,加入10%体积的Triton X-100进行处理后,采用超速离心法对其进行纯化,获得PEDV全病毒抗原,经BCA法测得浓度为3.95 mg/mL。2)检测母猪初乳中PEDV IgA抗体的间接ELISA方法的建立分别以纯化PEDV全病毒抗原和重组N蛋白作为包被抗原,建立检测母猪初乳中PEDV IgA抗体的间接ELISA方法,对各项反应条件进行优化,抗原最佳包被浓度为:PEDV全病毒抗原和重组N蛋白均为2 μg/mL,最佳封闭液为5%脱脂奶粉37℃封闭2h,乳汁样品最佳稀释倍分别为1:30和1:10,37℃反应60min;羊抗猪IgA-HRP工作浓度为1:10000,37℃反应60min:TMB 37℃反应15min。两个方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒阳性样品均为阴性,两个方法的重复性变异系数均小于10%,与BIONNTE公司商品化试剂盒比较,符合率分别为92.31%和88.46%,证明两种方法均具有较好的特异性、重复性及较高符合率,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。3)检测血清中PEDV IgG抗体的间接ELISA方法的建立分别以纯化PEDV全病毒抗原和重组N蛋白作为包被抗原,建立检测猪血清中PEDV IgG抗体的间接ELISA方法,对各项反应条件进行优化,抗原最佳包被浓度为:PEDV全病毒抗原为1μg/mL,重组N蛋白为4.92μg/mL,血清样品最佳稀释倍数分别为1:100和1:50,37℃反应60min;羊抗猪IgG-HRP工作浓度为1:5000,反应时间分别为37℃反应60min和37℃反应30min;TMB 37℃反应15min;两个方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒阳性样品均为阴性,两个方法的重复性变异系数均小于10%,最低检测限分别为1:1600和1:800,证明两种方法均可以为PEDV诊断和流行病学调查提供依据。综上所述,本研究利用PEDV全病毒抗原和重组N蛋白作为包被抗原,成功建立了间接ELISA抗体检测方法,为PEDV血清学诊断、免疫抗体检测及免疫学调查提供了简便、快速的检测手段。也为后续试剂盒的研发打下基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 中英文对照缩略词
• 文献综述
• 引言
• 1 材料
•   1.1 质粒、细胞、毒株和样品来源
•   1.2 主要试剂及耗材
•   1.3 试剂配制
•     1.3.1 蛋白纯化表达相关溶液配制
•     1.3.2 SDS-PAGE电泳相关试剂的配置
•     1.3.3 ELISA相关试剂的配制
•   1.4 主要仪器
• 2 方法
•   2.1 PEDV重组N蛋白的制备
•     2.1.1 pET 28B-N转入Rosetta细胞
•     2.1.2 诱导表达
•     2.1.3 SDS-PAGE分析
•     2.1.4 蛋白表达形式分析及纯化
•     2.1.5 纯化蛋白的Western blot鉴定
•     2.1.6 蛋白浓度测定
•   2.2 全病毒抗原的制备
•   2.3 乳汁中PEDV IgA抗体和血清中IgG抗体间接ELISA的建立
•     2.3.1 初乳样本的处理
•     2.3.2 优化抗原最佳包被浓度和样品稀释浓度
•     2.3.3 抗原最佳包被条件及包被液的选择
•     2.3.4 封闭液的选择
•     2.3.5 待检样品孵育时间的确定
•     2.3.6 酶标二抗最佳稀释度的确定
•     2.3.7 酶标二抗作用时间的确定
•     2.3.8 底物液作用时间的确定
•     2.3.9 阴、阳性临界值的确定
•   2.4 敏感性试验
•   2.5 特异性试验
•   2.6 重复性试验
•   2.7 符合率试验
•   2.8 间接ELISA方法的初步应用
• 3 结果与分析
•   3.1 PEDV重组N蛋白表达与纯化
•     3.1.1 表达产物的SDS-PAGE鉴定
•     3.1.2 诱导剂的浓度和反应温度的选择
•     3.1.3 诱导时间的选择
•     3.1.4 重组表达蛋白的表达分析和纯化
•     3.1.5 纯化重组蛋白的Western-blot鉴定
•     3.1.6 纯化重组蛋白浓度测定
•   3.2 检测母猪乳汁中PEDV IgA抗体间接ELISA方法的建立
•     3.2.1 基于重组N蛋白抗原间接ELISA方法的条件优化
•     3.2.2 基于全病毒抗原间接ELISA方法的条件优化
•   3.3 检测猪血清中PEDVIgG抗体间接ELISA方法的建立
•     3.3.1 基于PEDV全病毒抗原间接ELISA方法的条件优化
•     3.3.2 基于重组N蛋白抗原间接ELISA方法的条件优化
•   3.4 四种ELISA检测方法的敏感性实验
•   3.5 四种ELISA检测方法的重复性实验
•   3.6 四种ELISA检测方法的特异性试验
•   3.7 符合率试验
•   3.8 间接ELISA检测方法的初步应用
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 芮聪杰

导师: 许发芝,潘孝成

关键词: 猪流行性腹泻病毒,重组蛋白,抗体,间接

来源: 安徽农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 安徽农业大学

基金: 安徽省重点研究与开发计划项目(项目编号:1704a07020066)

分类号: S852.651

DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000482

总页数: 66

文件大小: 3981K

下载量: 72