PDCoV内切核糖核酸酶nsp15的结构与功能研究

论文摘要

猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）属于δ冠状病毒属。临床症状主要是引起新生仔猪产生严重的呕吐、腹泻和脱水,最终导致仔猪死亡。2014年,美国猪场遭受PDCoV大规模流行,经济损失严重。2016年,流行病学调查显示我国多个省份的规模化猪场呈PDCoV阳性。由于目前针对PDCoV开展的研究尚少,市场上暂无有效的药物和疫苗可用。因此,PDCoV对我国的养猪业具有潜在危害性,具有重要的研究价值。其中,PDCoV非结构蛋白15（non-structural protein,nsp15）属于尼多病毒目内切核糖核酸酶,能特异性切割双链或单链核苷酸尿嘧啶,参与病毒复制过程,是病毒重要的毒力蛋白。本研究首次发现、证实并阐释了PDCoV nsp15以二聚体发挥酶活的作用机制。提出了尼多病毒目内切核糖核酸酶的进化假说,也为PDCoV乃至冠状病毒的药物设计和疫苗研发提供了思路。主要包括以下四个方面:1.PDCoV nsp15以二聚体和单体形式存在通过大肠杆菌原核表达系统、镍离子金属螯合亲和层析（Ni-NTA）得到PDCoV nsp15（H234A）、严重急性呼吸综合征病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）nsp15（H234A）和猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）nsp15（H241A）蛋白。并利用尺寸排阻层析分子筛（Size exclusion chromatography,SEC）和超高速离心（Analytical ultracentrifugation,AUC）确认聚集形态和分子量大小。结果表明PDCoV nsp15以二聚体和单体形式存在,SARS-CoV nsp15和PEDV nsp15则主要以六聚体存在。2.PDCoV nsp15以二聚体发挥功能的关键区域验证通过氨基酸序列比对和三维结构比对分析,构建了以下突变体:PDCoV nsp15前27个氨基酸（1N-27N）截短突变体,PDCoV nsp151N-27N△;PDCoV nsp15 1N-27N替换为SARS-CoV nsp15的1S-27I突变体,PDCoV nsp151S-27I;SARS-CoV nsp15的259Q-279F替换为PDCoV nsp15的251H-261V突变体,SARS-CoV nsp15259Q-279F。通过SEC和AUC实验对以上蛋白的聚集形态分析发现:PDCoV nsp151N-27N△二聚体比例减少;SARS-CoV nsp15259Q-279F的六聚体显著减少,主要以单体和二聚体存在。PDCoV nsp151S-27I与SARS-CoV nsp151N-27N的聚集形态变化不明显。3.PDCoV nsp15突变体酶活的体外生化验证通过PDCoV和SARS-CoV nsp15的氨基酸序列比对结果,将保守的酶活催化位点（两个组氨酸和一个赖氨酸）和结合位点突变为丙氨酸,得到PDCoV nsp15突变体:H234A、H219A、K269A、D276A和SARS-CoV nsp15突变体:H234A、SARS-CoV nsp15 1S-27I截短突变体,SARS-CoV nsp151S-27I△。通过FRET实验验证以上突变体蛋白的体外酶切效率,结果表明在PDCoV nsp15突变体中,野生型具有最高的酶活性,其次是D276A、1N-27N△、H219A、K269A,其中H234A的酶活性最低;在SARS-CoV nsp15突变体中,259Q-279F具有最高的酶活性,其次是1S-27I△、nsp151N-27N,H234A的酶活性最低。4.内切核糖核酸酶三维结构比对分析和进化关系推演通过非洲爪蛙内切核糖核酸酶（Xenopus laevis oocyte endoribonuclease,XendoU）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory disease virus,PRRSV）nsp11、SARS-CoV和PDCoV nsp15单体的三维结构比对分析,发现它们具有保守的酶活催化Loop（Active Loop）和支撑Loop（Supporting Loop）。在XendoU中,Supporting Loop和其它loops足以支撑Active Loop以单体存在;而在PRRSV nsp11、PDCoV和SARS-CoV nsp15中,Active Loop朝向转变,倒向Supporting Loop;因此,单独的Supporting Loop并不能支持Active Loop,而需要形成二聚体或更高的聚集形态进而稳定酶活中心。由此,推测尼多病毒的进化历程如下:内切核糖核酸酶来自真核生物的XendoU（单体）,在动脉炎病毒中进化成为二聚体,在冠状病毒中进化成六聚体。PDCoV nsp15作为两者进化过程的中间物,其二聚体聚集形态首次被发现。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（Abbreviation）
• 第一章 文献综述
•   1.1 猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）
•     1.1.1 PDCoV流行病学调查
•     1.1.2 PDCoV临床症状和病理特征
•   1.2 PDCoV分子生物学特征
•     1.2.1 PDCoV形态特征和基因组结构
•   1.3 尼多病毒概况
•     1.3.1 尼多病毒的入侵、复制和释放
•     1.3.2 尼多病毒的基因组进化
•     1.3.3 尼多病毒目内切核糖核酸酶
•   1.4 冠状病毒内切核糖核酸酶
•     1.4.1 冠状病毒内切核糖核酸酶生物学功能
•     1.4.2 冠状病毒内切核糖核酸酶聚集形态
•   1.5 蛋白质聚集形态分析
•     1.5.1 蛋白质的原核表达与纯化
•     1.5.2 分子排阻层析和分析超速离心
•   1.6 荧光共振能量转移
• 第二章 研究目的与意义
• 第三章 材料与方法
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 基因来源
•     3.1.2 菌株及质粒
•     3.1.3 工具酶和主要试剂
•     3.1.4 蛋白表达试剂配制
•     3.1.5 核酸胶电泳缓冲液配制
•     3.1.6 蛋白纯化缓冲液配制
•     3.1.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液及试剂
•     3.1.8 实验仪器及设备
•     3.1.9 分子生物学分析软件
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 目的基因扩增
•       3.2.1.1 nsp15 基因引物序列
•       3.2.1.2 PCR扩增条件
•       3.2.1.3 PCR产物胶回收
•       3.2.1.4 目的DNA片段与载体质粒重组反应
•       3.2.1.5 重组质粒转化至感受态细胞
•       3.2.1.6 菌液PCR鉴定
•       3.2.1.7 DH5α重组质粒小提
•       3.2.1.8 质粒转化表达菌株感受态细胞
•       3.2.1.9 阳转质粒表达菌株冻存
•     3.2.2 原核表达质粒构建
•       3.2.2.1 引物
•       3.2.2.2 PDCoV、SARS-CoV及 PEDV nsp15 基因PCR扩增
•       3.2.2.3 PCR产物CP回收
•       3.2.2.4 限制性内切酶酶切反应
•       3.2.2.5 酶切目的片段与酶切载体质粒连接反应
•       3.2.2.6 质粒和PCR产物的测定
•     3.2.3 蛋白表达与纯化
•       3.2.3.1 重组蛋白小量预表达实验
•       3.2.3.2 重组蛋白大量表达与纯化
•       3.2.3.3 SDS-PAGE检验纯化后蛋白
•       3.2.3.4 Ni-NTA层析柱再生
•       3.2.3.5 分子筛层析实验
•       3.2.3.6 分子排阻层析分子筛
•     3.2.4 分析型超高速离心实验
•     3.2.5 内切核糖核酸酶（NendoU）体外酶活测定
•     3.2.6 序列分析和结构模拟
• 第四章 结果与分析
•   4.1 PDCoV nsp15 蛋白表达和纯化
•   4.2 PDCoV nsp15 蛋白聚集形态分析
•     4.2.1 SARS-CoV和 PEDV nsp15 基因克隆
•     4.2.2 分子筛标准品分析
•     4.2.3 蛋白质分子排阻层析
•     4.2.4 蛋白质超速离心分析
•   4.3 PDCoV nsp15 二聚体形成原因分析
•     4.3.1 PDCoV nsp15 三维结构模拟
•     4.3.2 PDCoV nsp15 NTD突变体蛋白聚集形态分析
•     4.3.3 SARS-CoV nsp15 突变体蛋白聚集形态分析
•     4.3.4 SARS-CoV和 PDCoV nsp15 三维结构分析
•   4.4 内切核糖核酸酶（EndoU）体外酶活功能研究
•     4.4.1 PDCoV nsp15 突变体蛋白体外酶活分析
•     4.4.2 SARS-CoV nsp15 突变体蛋白体外酶活分析
•   4.5 NendoU和 XendoU功能结构域保守性分析
•   4.6 NendoU和 XendoU氨基酸序列同源性分析
• 第五章 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郑安君

导师: 傅振芳,彭贵青

关键词: 猪德尔塔冠状病毒,内切核糖核酸酶,非结构蛋白,超高速离心,六聚体,二聚体,进化

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

分类号: S852.651

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000596

总页数: 72

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