粪肠球菌噬菌体EF-P10及其裂解酶生物学特性与实验治疗的研究

论文摘要

细菌耐药性问题日趋严重,使得有些细菌感染达到了无药可用的境地,因此研发新型抗菌药物成为人们关注的焦点。噬菌体及其裂解酶可以特异、高效地裂解细菌,成为治疗细菌性感染,特别是耐药性细菌感染的一种新型生物制剂,展现出了巨大的应用潜力。粪肠球菌（Enterococcus faecalis）是一种机会致病菌,可以造成多种局部或全身性的感染性疾病。由于抗生素的滥用和粪肠球菌对许多抗生素的固有耐药,使得临床上由治疗粪肠球菌造成的感染变得非常困难。本研究以耐万古霉素粪肠球菌噬菌体EF-P10及其裂解酶LysEF-P10为研究对象,对其作为抗菌制剂的应用潜力及其裂解机制进行了系统研究。本研究首先获得了40株多重耐药的粪肠球菌,并以耐万古霉素的粪肠球菌（Vancomycin-resistant Enterococcus faecalis,VREF）N10为宿主菌从污水中分离并纯化得到了一株烈性噬菌体EF-P10,透射电镜显示其属于长尾噬菌体科,基因组类型鉴定表明EF-P10为双链DNA病毒。EF-P10对其宿主菌表现出了高效的杀菌活性,但裂解谱较窄。对EF-P10进行了全基因组测序,发现EF-P10全长为57 408 bp,具有127个开放阅读框,比对和分析结果表明ORF60所编码的蛋白为其裂解酶LysEF-P10。对LysEF-P10进行了原核表达与纯化,体外实验表明,LysEF-P10具有高效的杀菌活性,其裂解谱远远宽于亲本噬菌体。将粪肠球菌与LysEF-P10连续作用多代不会诱导细菌对LysEF-P10产生抗性,预示其有广阔的应用前景。随后,本研究对LysEF-P10的结构和功能进行了深入研究,通过氨基酸序列比对和分析可知,LysEF-P10包含一个N端CHAP结构域（LysEF-P10C）和C端的假定细胞壁结合结构域（LysEF-P10B）。为了验证各结构域的功能,分别对LysEF-P10C和LysEF-P10B进行了原核表达和纯化。体外杀菌实验表明单独的LysEF-P10C和LysEF-P10B都不具有杀菌活性,只有完整的全酶才具有活性。为了直观地看到与宿主菌结合的结构域,将LysEF-P10C、LysEF-P10B分别和GFP蛋白进行融合,得到LysEF-P10C-GFP和LysEF-P10B-GFP融合蛋白,并用激光共聚焦显微镜检测两个融合蛋白与粪肠球菌N10的结合能力,结果只有LysEF-P10B-GFP能与粪肠球菌N10发生特异性结合,表明LysEF-P10B是LysEF-P10中发挥结合作用的结构域。以金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysGH15的CHAP片段为模板,预测得到了置信度为100%的LysEF-P10C的3D结构,二者在结构上具有很高的同源性。通过序列比对和构建的3D结构模型,预测得到了LysEF-P10C中可能的关键氨基酸位点D20、D22、D31、C29、H90和N110,并将这些位点逐一单位点突变为丙氨酸。圆二色谱结果表明,突变前后蛋白的二级结构没有发生改变。体外杀菌活性表明,EDTA处理后LysEF-P10的活性全部丧失,回补Ca2+活性恢复,这表明Ca2+对维持LysEF-P10的杀菌活性是必需的;D20A、D22A和D31A突变体蛋白活性全部丧失,ICP-AES结果表明突变后Ca2+含量显著降低,回补Ca2+后突变体蛋白活性并没有恢复,这表明D20、D22和D31是结合Ca2+的关键位点;C29A、H90A和N110A突变体蛋白的活性也全部丧失,但ICP-AES结果表明突变后Ca2+含量没有显著变化,说明这三个位点是起催化作用的关键位点。本文进一步评价了LysEF-P10在体内的治疗效果、免疫原性、对肠道菌群的影响及其安全性。治疗实验表明,攻菌后1 h腹腔注射5.0μg LysEF-P10就可以100%保护感染致死剂量VREF的小鼠,且显著降低小鼠血液中的载菌量。免疫原性实验表明LysEF-P10可以诱导小鼠产生针对LysEF-P10的特异性抗体,一次性注射5.0μg LysEF-P10后的第三周抗体滴度达到最高（1:100）,主要抗体类型为IgG。中和实验表明anti-LysEF-P10的抗体并不会影响LysEF-P10在体外的杀菌活性,同时体内实验也表明特异性抗体不会影响LysEF-P10在体内的治疗效果。为了评价LysEF-P10在体内应用时对肠道菌群的影响,对小鼠粪便中的细菌进行16S rRNA测序分析,结果表明,当给小鼠腹腔注射致死剂量的VREF 24 h后小鼠粪便中肠球菌属细菌的丰度显著升高,肠道菌群平衡状态受到干扰;攻菌后1 h用5.0μg LysEF-P10对其进行治疗,小鼠粪便中肠球菌属细菌的丰度显著降低,肠道菌群的失衡状态得到一定程度的恢复。单独腹腔注射100.0μg LysEF-P10也会在24 h内使小鼠粪便中肠球菌属细菌的丰度显著降低。对小鼠的安全性试验表明,即使腹腔注射大剂量LysEF-P10（5.0 mg）也不会对小鼠产生明显的副作用,表明LysEF-P10在体内应用时具有良好的安全性。综上所述,本研究为全面解析粪肠球菌噬菌体及其裂解酶的生物学特性以及LysEF-P10在治疗多重耐药粪肠球菌感染中应用打下了坚实的理论与实验基础。

论文目录

• 中文摘要
• abstract
• 英文缩写词
• 前言
• 第一篇 文献综述
•   第一章 粪肠球菌的研究进展
•     1.1 粪肠球菌的概述
•     1.2 粪肠球菌引起的临床疾病
•       1.2.1 感染性心内膜炎（Infective endocarditis,IE）
•       1.2.2 尿路感染（Urinary tract infection,UTI）
•       1.2.3 血液感染（Bloodstream infection,BSI）
•       1.2.4 慢性根尖周炎（chronic apical periodontitis）
•     1.3 粪肠球菌的耐药性
•     1.4 粪肠球菌在兽医中的危害
•   第二章 噬菌体及其应用的研究进展
•     2.1 噬菌体概述
•     2.2 噬菌体作为抗菌生物试剂的应用
•       2.2.1 噬菌体在医学临床中的应用
•       2.2.2 噬菌体在畜牧生产、水产养殖中的应用
•       2.2.3 噬菌体在食品安全中的应用
•       2.2.4 粪肠球菌噬菌体的相关研究
•   第三章 噬菌体裂解酶的研究进展
•     3.1 裂解酶概述
•     3.2 裂解酶的应用
•       3.2.1 裂解酶在医学当中的应用
•       3.2.2 裂解酶在食品安全中的应用
•       3.2.3 粪肠球菌噬菌体裂解酶的应用
•     3.3 裂解酶应用的安全性
•     3.4 细菌对裂解酶的抗性
•     3.5 裂解酶的抗原性
•     3.6 裂解酶与抗菌制剂的协同作用
•     3.7 展望
• 第二篇 研究内容
•   第1章 耐万古霉素粪肠球菌及其噬菌体的分离鉴定
•     1.1 材料
•       1.1.1 菌株
•       1.1.2 主要试剂及仪器
•       1.1.3 主要试剂的配置
•       1.1.4 引物
•     1.2 方法
•       1.2.1 粪肠球菌的分离
•       1.2.2 粪肠球菌噬菌体的分离及一般生物学特征
•     1.3 结果
•       1.3.1 粪肠球菌的分离鉴定
•       1.3.2 噬菌体EF-P10 的分离、纯化及一般生物学特性
•     1.4 讨论
•     1.5 小结
•   第2章 噬菌体EF-P10 的全基因组测序和分析
•     2.1 材料
•       2.1.1 菌株及噬菌体
•       2.1.2 主要试剂及仪器
•     2.2 方法
•       2.2.1 噬菌体EF-P10 的扩增和浓缩
•       2.2.2 噬菌体EF-P10 的核酸提取和测序
•       2.2.3 噬菌体EF-P10 全基因组的比对分析
•     2.3 结果
•       2.3.1 噬菌体EF-P10 的浓缩
•       2.3.2 噬菌体EF-P10 核酸的提取
•       2.3.3 噬菌体EF-P10 的基因组分析
•     2.4 讨论
•     2.5 小结
•   第3章 重组裂解酶LysEF-P10 的制备及其体外作用机制
•     3.1 材料
•       3.1.1 主要试剂
•       3.1.2 主要仪器
•       3.1.3 主要试剂的配置
•       3.1.4 主要菌株和质粒
•       3.1.5 引物
•     3.2 方法
•       3.2.1 裂解酶LysEF-P10 与同源蛋白的比对分析
•       3.2.2 裂解酶p ET-15b-Lys EF-P10 载体的构建及蛋白表达、纯化..
•       3.2.3 LysEF-P10 体外活性的测定
•       3.2.4 细菌对LysEF-P10 的体外抗性产生
•       3.2.5 裂解酶LysEF-P10 单独结构域的原核表达及活性测定.
•       3.2.6 LysEF-P10C-GFP和 LysEF-P10B-GFP结合活性测定
•       3.2.7 LysEF-P10的3D结构的预测和关键作用位点的分析
•       3.2.8 统计学分析
•     3.3 结果
•       3.3.1 LysEF-P10 与同源蛋白的比对分析
•       3.3.2 LysEF-P10 的原核表达与纯化
•       3.3.3 LysEF-P10 体外杀菌活性
•       3.3.4 LysEF-P10C和 LysEF-P10B的原核表达和纯化
•       3.3.5 LysEF-P10C和 LysEF-P10B体外杀菌活性的测定
•       3.3.6 LysEF-P10C-GFP和 LysEF-P10B-GFP结合活性的测定
•       3.3.7 LysEF-P10的3D结构的预测
•       3.3.8 LysEF-P10C的关键作用位点的分析
•     3.4 讨论
•     3.5 小结
•   第4章 裂解酶Lys EF-P10 的实验治疗及对肠道菌群影响
•     4.1 材料
•       4.1.1 主要试剂
•       4.1.2 主要仪器
•       4.1.3 主要菌株
•       4.1.4 实验动物
•     4.2 方法
•       4.2.1 LysEF-P10 体内活性的测定
•       4.2.2 LysEF-P10 的免疫原性
•       4.2.3 一次性大剂量应用LysEF-P10 对组织脏器的影响
•       4.2.4 LysEF-P10 对小鼠肠道菌群的影响
•     4.3 结果
•       4.3.1 LysEF-P10 体内杀菌活性
•       4.3.2 LysEF-P10 的免疫原性
•       4.3.3 一次性大剂量应用LysEF-P10 对组织脏器的影响
•       4.3.4 LysEF-P10 对小鼠肠道菌群的影响
•     4.4 讨论
•     4.5 小结
• 结论
• 创新点
• 参考文献
• 导师简介
• 作者简介
• 攻读博士期间发表的学术论文及其他成果
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 程梦珺

导师: 韩文瑜

关键词: 粪肠球菌,噬菌体,裂解酶,关键氨基酸位点,肠道菌群

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林大学

基金: “国家自然科学基金” (No.31502103 和 No.31572553),国家重点研发计划(2017YFD0501000)

分类号: S852.611

总页数: 152

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