嗜根考克氏菌DC2201翻译延伸因子P基因的克隆、表达及其单克隆抗体的制备

论文摘要

EF-P（Elongation factor P）是广泛存在于细菌中的蛋白质翻译延伸因子,其主要功能是减缓由新生肽链上的聚脯氨酸序列引起的核糖体翻译延宕并促进肽键的合成。此外,EF-P蛋白的翻译后修饰对其功能的发挥起着重要的作用。目前国内外鲜见有关放线菌纲EF-P蛋白的翻译后修饰方式的研究报道,阐明其翻译后修饰方式对其生命活动的研究具有重大的生物学意义。本论文选取嗜根考克氏菌DC2201为研究材料,通过大肠杆菌异源表达其EF-P蛋白,并利用重组蛋白EF-P作为免疫抗原制备抗EF-P重组蛋白的单克隆抗体,获得的单克隆抗体可用于钓取嗜根考克氏菌DC2201天然蛋白EF-P,以期为解析其翻译后修饰方式奠定实验基础。具体内容及结果如下:1嗜根考克氏菌DC2201 EF-P蛋白的生物信息学分析、表达及鉴定首先经生物信息学分析,efp基因全长为564 bp,编码氨基酸187个,蛋白质理论分子量为21 kDa左右,为亲水性的酸性细胞质蛋白。其主要的二级结构是β折叠;通过对其系统进化分析,表征EF-P的保守性较高。其次利用分子生物学的手段成功构建了重组克隆载体pMD19-T-efp以及重组表达载体pET-29a（+）-efp,且通过诱导表达、镍离子亲和层析柱纯化及SDS-PAGE、MALDI-TOF-TOF鉴定,获得了大小约为25 kDa的重组蛋白EF-P。2重组蛋白EF-P诱导表达条件的优化优化表达条件（诱导起始菌体浓度、诱导温度、IPTG终浓度、诱导时间）以获得大量可溶性目的蛋白。最终确定其表达优化条件是:在OD600nm=0.4,诱导温度为20℃时,以终浓度为0.7 mmol/L的IPTG对含有重组表达载体的表达宿主诱导6 h。3抗EF-P重组蛋白的单克隆抗体的制备以纯化的EF-P重组蛋白作为免疫抗原免疫Balb/c小鼠,进行细胞融合、阳性杂交瘤细胞的筛选、亚克隆筛选单细胞,最终通过体内诱生法成功获取5株小鼠腹水,且腹水效价在1:128000至1:512000之间。对其中的3D3号腹水进行分离纯化及鉴定,最终获得纯度较高、特异性较好的抗EF-P重组蛋白的单克隆抗体。上述研究结果为后续研究嗜根考克氏菌DC2201天然EF-P翻译后修饰方式、探究EF-P的翻译后修饰对嗜根考克氏菌DC2201的生物学意义奠定了物质基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 绪论
•   1.1 EF-P的研究进展
•     1.1.1 EF-P的研究历程
•     1.1.2 EF-P的结构
•     1.1.3 EF-P在细菌中的生物学意义
•     1.1.4 EF-P的翻译后修饰
•   1.2 考克氏菌属概述
•     1.2.1 考克氏菌的鉴定
•     1.2.2 嗜根考克氏菌的应用
•   1.3 单克隆抗体的原理及应用
•   1.4 研究的目的及意义
•   1.5 研究内容及技术路线
• 2 嗜根考克氏菌DC2201 翻译延伸因子P基因的表达与鉴定
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验菌株与质粒
•     2.1.2 实验主要试剂
•     2.1.3 实验主要溶液及其配制
•     2.1.4 主要实验仪器设备
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 efp基因表达产物EF-P的生物信息学分析
•     2.2.2 嗜根考克氏菌DC2201 全基因组的提取
•     2.2.3 efp基因的扩增
•     2.2.4 胶回收目的基因产物
•     2.2.5 重组克隆载体pMD19-T-efp的构建
•     2.2.6 重组表达载体pET-29a（+）-efp的构建
•     2.2.7 目的重组蛋白EF-P的诱导表达
•     2.2.8 SDS-PAGE检测重组蛋白EF-P的表达情况
•     2.2.9 重组蛋白EF-P的纯化及鉴定
•   2.3 实验结果与分析
•     2.3.1 efp基因表达产物EF-P的生物信息学分析
•     2.3.2 嗜根考克氏菌DC2201 全基因组的提取
•     2.3.3 efp基因的扩增
•     2.3.4 重组克隆载体pMD19-T-efp的鉴定
•     2.3.5 重组表达载体pET-29a（+）-efp的鉴定
•     2.3.6 目的重组蛋白EF-P的诱导表达
•     2.3.7 重组蛋白EF-P的纯化及鉴定
•   2.4 本章小结
• 3 嗜根考克氏菌DC2201 EF-P重组蛋白诱导表达条件的优化
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验菌株
•     3.1.2 实验主要试剂
•     3.1.3 实验主要溶液及其配制
•     3.1.4 主要实验仪器设备
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 起始菌体浓度对EF-P重组蛋白表达的影响
•     3.2.2 温度对EF-P重组蛋白表达的影响
•     3.2.3 诱导剂终浓度对EF-P重组蛋白表达的影响
•     3.2.4 诱导时间对重组蛋白EF-P表达的影响
•     3.2.5 诱导温度对重组蛋白EF-P可溶性表达的影响
•   3.3 实验结果与分析
•     3.3.1 诱导起始菌体浓度对重组蛋白EF-P表达的影响
•     3.3.2 诱导温度对重组蛋白EF-P表达的影响
•     3.3.3 IPTG终浓度对重组蛋白EF-P表达的影响
•     3.3.4 诱导时间对重组蛋白EF-P表达的影响
•     3.3.5 诱导温度对重组蛋白EF-P可溶性表达的影响
•   3.4 本章小结
• 4 抗EF-P重组蛋白单克隆抗体的制备
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 实验动物及细胞
•     4.1.2 主要实验试剂
•     4.1.3 实验主要溶液及其配制
•     4.1.4 主要实验仪器设备
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 Balb/c小鼠的免疫
•     4.2.2 间接ELISA确定最佳包被浓度及血清效价
•     4.2.3 细胞融合
•     4.2.4 阳性杂交瘤细胞的筛选
•     4.2.5 阳性细胞株的亚克隆
•     4.2.6 制备含单克隆抗体的小鼠腹水
•     4.2.7 辛酸-硫酸铵法粗提纯腹水中的单克隆抗体
•     4.2.8 Protein G亲和层析柱纯化单克隆抗体
•     4.2.9 利用Western blotting鉴定单克隆抗体的特异性
•   4.3 实验结果与分析
•     4.3.1 棋盘滴定法测定最佳抗原浓度及血清稀释倍数
•     4.3.2 间接ELISA法确定细胞融合小鼠
•     4.3.3 细胞融合筛选阳性杂交瘤细胞的结果
•     4.3.4 阳性细胞亚克隆筛选结果
•     4.3.5 腹水效价的测定
•     4.3.6 由3D3 号腹水提纯的单克隆抗体效价变化
•     4.3.7 Western blotting鉴定单克隆抗体的特异性
•   4.4 本章小结
• 5 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 在读期间公开发表论文（著）及科研情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨娇娇

导师: 龙中儿

关键词: 嗜根考克氏菌,表达,条件优化,单克隆抗体

来源: 江西师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 江西师范大学

基金: 国家自然科学基金,江西省自然科学基金

分类号: Q78;Q93

DOI: 10.27178/d.cnki.gjxsu.2019.000650

总页数: 72

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