紫金矿区重金属耐性菌株Mucilaginibacter rubeus P3的分离、鉴定、基因组分析及其应用研究

论文摘要

本研究从福建省龙岩市上杭县旧县镇才溪镇紫金山金铜矿区土样分离出对砷（As）、镉（Cd）、锌（Zn）和铜（Cu）同时具有抗性的菌株Mucilaginibacter rubeus P3（M.rubeus P3）。通过全基因组分析阐明了菌M.rubeus P3对重金属的抗性机制;通过室内温室培养试验,研究了菌株M.rubeus P3对不同浓度As（Ⅲ）胁迫下水稻生长的影响,探索了其在修复重金属污染环境的应用前景。（1）菌株筛选为筛选出重（类）金属耐性菌株,我们将用PBS梯度稀释后的土样分别涂布于含有2 mM、4 mM、8 mM Cu2+的R2A固体平板上,从中分离出了19株具有Cu2+耐受性的细菌,命名为C8、C13、C14（M.rubeus P3）、C16、C18、C22、C23、C24、C25、C27、C29、C33、C34、C35、C39、C41、C42、C43和C50,其中C13、C14、C41和C42菌落呈粉红色形态类似,单细胞SEM结果类似,且后续的植物促生试验发现C14的植物促生效果最为显著,故本研究采用C14作为后续研究材料。最小抑制浓度（MIC,Minimum inhibition concentration）实验发现:菌株C14对Zn2+、Cu2+、As3+和Cd2+的最小抑制浓度分别为21 mM、3.5 mM、4.5 mM、0.2 mM。（2）种属鉴定通过16s rRNA对比分析,C14菌隶属于Actinobacteria门Sphingobacteria纲Sphingobacteriales目Sphingobacteriaceae科Mucilaginibacter属。基于16S rRNA的系统发育进化树分析发现,C14与Mucilaginibacter rubeus EF23T（KX792140）、Mucilaginibacter gossypii Gh-67T（jgi.1071184）、Mucil-aginibacter gossypiicola Gh-48T（EU672805）的亲缘关系最接近,相似度分别达99.93%、98.99%、97.55%。细菌的分类学和基因组分析进一步表明,C14是一株严格好氧的无孢子且无运动性的革兰氏阴性菌。（3）基因组分析通过全基因组测序（基因草图及注释）数据分析发现:菌株C14的基因组大小是7125794 bp,其含有6190个蛋白质编码的基因,与tRNA编码的基因有45个,rRNA编码的基因有3个。分析发现:·菌株C14含有多Cu氧化酶基因（multicopper oxidase,mco）6个,它可使用Cu离子作为辅酶来氧化各种有机底物或无机底物。而三联外排系统相关基因cusCBA能利用蛋氨酸残基结合并输出微生物体内累积的Cu（I）或Ag（I）。·As操纵子相关基因3个,分别是arsNC1R1、acr3、arsMC2R2,其中acr3基因的表达对亚砷酸盐[As（Ⅲ）]具有一定的抗性。·锌(Zn2+)和镉(Cd2+)耐性相关的基因有10个,且含有czc（Cd,Zn和Co二价阳离子抗性决定簇）系统。·同时,分析发现C14含有27个同植物促生及胞外多糖分泌相关的基因,其中1个Pel和1个psl可能参与生物膜形成。实验发现:C14在R2A固体培养基上可形成生物膜并分泌粉红色色素。因此,上述结果表明:在重金属胁迫下,C14可能通过分泌大量的胞外多糖（主要有粘液多糖、荚膜多糖）可结合部分重金属,来提高其对重金属的耐受性。（4）菌株的形态及生长特性:该菌株C14为圆形,不透明,表面凸起、光滑、边缘平整、湿润且无鞭毛、呈杆状,长0.3-0.4 um,宽1.1-1.3 um。R2A培养基是菌株C14的最适培养基,它的最适生长温度、最适生长NaCl、最适生长pH分别为28°C、1.0%（w/v）和5。（5）C14植物促生试验发现:与不加As（Ⅲ）的对照组,不同浓度As（Ⅲ）处理显著地提高菌C14的IAA（吲哚乙酸,International Academy of Astronautics）产量,其中1.2 mg L-1 As（Ⅲ）处理下C14的IAA产量最高。溶磷实验发现:菌株在无机磷培养基上生长旺盛并产生透明的溶磷圈,而在有机磷培养基上没有透明的溶磷圈产生,表明菌株C14可溶解无机磷,却不能溶解有机磷。水稻水培实验发现:不同浓度的As（Ⅲ）胁迫可抑制水稻根系生长,造成根系不同程度的褐化或发黑;在As（Ⅲ）胁迫下,接种C14可显著地提高水稻根系活力（根系更白,更粗）。与单一As（Ⅲ）处理相比,As（Ⅲ）和加菌C14复合处理能增加水稻叶绿素和N含量。但是接种该菌未能显著增加As（Ⅲ）胁迫下水稻的生物量、根长、株高等生物学指标,因此,该菌株的促生效果及其较佳的促生条件还需进一步的实验验证。综上所述,本研究通过16S rRNA对比分析,对分离自紫金矿区的菌（C14）进行了科属关系鉴定;结合基因组学和生理生化分析技术,研究了C14的生长特性、优化了最佳生长条件,同时获得了相关重金属耐性基因信息;最后利用温室水培实验,试图验证C14的植物促生效果,以期为该菌在修复重金属污染农田的应用提供一定的理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
•   1.我国重金属污染现状及危害
•   2.降低农作物体内重金属含量的技术
•   3.微生物降低植物吸收重金属的机制
•   4.微生物的促进植物生长的机制
•   5.微生物的分类及鉴定
•     5.1 微生物分类及鉴定的内容
•     5.2 微生物分类及鉴定的研究手段
•       5.2.1 微生物生长特性的观察
•       5.2.2 微生物分类及鉴定的分子生物学技术
•   6.微生物基因功能分析
•     6.1 基因组测序技术
•     6.2 基因组测序数据分析
•   7.SPHINGOBACTERIACEAE科和MUCILAGINIBACTER属简介
•   8.研究目的、意义及技术路线
• 第二章 材料与方法
•   1.C14的分类学鉴定
•     1.1 实验材料
•       1.1.1 样品采集
•       1.1.2 培养基的配制
•     1.2 实验方法
•       1.2.1 菌株筛选
•       1.2.2 菌株C14 最优培养基的测定
•       1.2.3 菌株C14 的形态学特征
•       1.2.4 生长特性
•       1.2.5 API ZYM系统检测
•       1.2.6 菌株种属关系鉴定
•   2.C14 的基因组分析
•     2.1 实验材料
•     2.2 实验方法
•       2.2.1 总DNA提取
•       2.2.2 基因组测序
•       2.2.3 原始数据过滤
•       2.2.4 基因组组装
•       2.2.5 基因组注释及分析
•   3.菌株C14 溶磷作用和分泌IAA能力测试
•     3.1 溶磷作用
•       3.1.1 定性测定
•     3.2 IAA的产生及定量测定
•       3.2.1 定量测定
•   4.C14对As胁迫下水稻幼苗生长的影响
•     4.1 材料方法
•       4.1.1 供试材料
•     4.2 水稻育苗、移栽与日常管理
•       4.2.1 泡种
•       4.2.2 催芽
•       4.2.3 两叶一芯期
•     4.3 实验设计
•     4.4 水稻样品采集过程
•     4.5 统计与分析
• 第三章 结果与讨论
•   1.菌株C14 的分离鉴定
•     1.1 菌株C14 的分离纯化
•     1.2 菌株C14 最优培养基检测
•     1.3 菌株C14 重（类）金属MIC检测
•     1.4 API ZYM检测
•     1.5 土壤菌群的多样性分析
•   2.C14 的分类学鉴定
•     2.1 基因型特征
•       2.1.1 16S rRNA基因序列及其同源性比对结果
•       2.1.2 系统发育树的构建与分析
•     2.2 表型特征
•       2.2.1 形态学特征
•       2.2.2 生长特性
•   3.C14 的基因组分析
•     3.1 C14 菌株基本信息
•     3.2 C14 基因测序信息
•     3.3 C14 基因组注释结果分析
•   4.C14 潜在促生机制
•     4.1 溶磷能力
•     4.2 分泌IAA能力
•   5.AS胁迫下C14 对水稻生长的影响
•     5.1 C14对AS（Ⅲ）胁迫下水稻株高、根长和鲜重的影响
•     5.2 C14对AS（Ⅲ）胁迫下水稻叶绿素SPAD值和N含量的影响
• 第四章 展望
• 参考文献
• 附录
• 缩写词英汉对照
• 在学期间已发表和录用的论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨楠

导师: Rensing Christopher

关键词: 重金属污染,植物促生,基因组学分析

来源: 福建农林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用

单位: 福建农林大学

分类号: X172

总页数: 67

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