标签谷胱甘肽S-转移酶的二价亲和标记试剂的制备与应用

论文摘要

设计合成融合表达标签谷胱甘肽S-转移酶（GST）的二价亲和标记试剂,用于功能化磁珠后位点选择性固定化标签GST,为磁分离筛选配体混合物库提供固定化融合靶蛋白的候选方案。为减少疏水配体在标签GST活性位点的结合,需同时占据标签GST双活性中心内疏水结合位点并发生共价修饰的二价亲和标记试剂。以双苯环为疏水定位基、溴乙酰基为巯基修饰基团、羧基为连接官能团得单价标记试剂,以二乙基三胺为连接臂将单价标记试剂与连接臂两端伯胺连接得标签GST的对称二价亲和标记试剂,再以线性三胺连接臂中间的氨基与羧基磁珠偶联得功能化磁珠。表征目标化合物对标签GST的标记动力学、结合比;功能化磁珠对标签GST的不可逆固定化动力学和固载容量,及将磁珠表面二价亲和标记试剂转变成还原型谷胱甘肽（GSH）加合物后对标签GST可逆固定化的效果;以碱性磷酸酶及疏水荧光配体为模型考察磁珠固定化标签GST后的非特异结合。目标化合物对标签GST半抑制浓度为（22±0. 2）μmol/L,其与GSH的饱和加合物半抑制浓度为（0. 41±0. 06）μmol/L,二者与标签GST二聚体结合比接近1∶1。功能化磁珠对标签GST不可逆及可逆固定化的容量均接近25 mg/g磁珠。偶联GST的磁珠对蛋白非特异吸附很弱,再进一步用单价亲和标记试剂和GSH加合物封闭固定化标签GST剩余的活性位点后对疏水小分子也无显著结合。结果表明,所设计二价亲和标记试剂功能化磁珠适合用于标签GST及其融合表达蛋白的位点选择性固定化。

论文目录

• 1 实验部分
•   1.1 仪器和试剂
•   1.2 亲和标记试剂的制备
•     1.2.1 对甲氧基苯氧乙基溴 （1）
•     1.2.2 N-对甲氧基苯氧乙基甘氨酸乙酯 （2） 的合成
•     1.2.3 二碳酸二叔丁酯[ （Boc） 2O]保护对氨基苯甲酸
•     1.2.4 N-对甲氧基苯氧乙基-N'-叔丁氧甲酰胺基苯甲酸甘氨酸乙酯 （3） 及其酸 （4）
•     1.2.5 单价标记试剂 （Br-Ⅰ）
•     1.2.6 二价标记试剂 （Br-Ⅱ）
•   1.3 目标化合物对sj GST的标记
•     1.3.1 sj GST的重组表达
•     1.3.2 连续跟踪sj GST催化显色底物CDNB和GSH反应测定活性
•     1.3.3 Br-Ⅱ及其与GSH酶催化原位生成加合物对sj GST半抑制浓度 （IC50）
•     1.3.4 标记失活速率常数 （kinact）
•     1.3.5 据剩余酶活性对标记试剂Br-Ⅱ量响应测定结合比
•     1.3.6 荧光滴定表征Br-Ⅱ与GSH加合物对sj GST的结合比
•   1.4 磁珠偶联Br-Ⅱ对sj GST的固定化及表征
•     1.4.1 Br-Ⅱ偶联磁珠 （D-MSP） 的制备
•     1.4.2 磁珠偶联Br-Ⅱ对sj GST的不可逆固定化动力学及其固定化容量
•     1.4.3 D-MSP自催化可逆固定化sj GST动力学及其固定化容量
•     1.4.4 SDS-PAGE检测D-MSP对sj GST的固定化
•     1.4.5 D-MSP对碱性磷酸酶的非特异性结合
•     1.4.6 D-MSP及sj GST固定化磁珠对疏水小分子的非特异性吸附
•     1.4.7 固定化sj GST D-MSP的稳定性考察
• 2 结果与讨论
•   2.1 游离试剂的标记失活速率常数 （kinact）
•   2.2 游离Br-Ⅱ及其与GSH加合物对sj GST的半抑制浓度 （IC50）
•   2.3 通过剩余酶活性对抑制剂响应测定Br-Ⅱ对GST的结合比
•   2.4 荧光猝灭检测Br-Ⅱ与GSH在酶催化原位生成加合物对GST的结合比
•   2.5 磁珠偶联Br-Ⅱ对sj GST的可逆及不可逆固定化
•   2.6 SDS-PAGE检测D-MSP对sj GST的可逆与不可逆固定化
•   2.7 比较D-MSP及羧基磁珠对蛋白的非特异性吸附
•   2.8 D-MSP固定化sj GST后对小分子的非特异性吸附
•   2.9 D-MSP可逆固定化sj GST的稳定性
• 3 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 卢进鹏,夏超,周伟,李亚平,胡小蕾,廖飞,杨晓兰

关键词: 谷胱甘肽转移酶,亲和标记试剂,磁珠,固定化

来源: 应用化学 2019年04期

年度: 2019

分类: 工程科技Ⅰ辑

专业: 有机化工

单位: 重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室,重庆理工大学药学与生物工程学院

基金: 国家自然科学基金(31570862,81773625)资助项目~~

分类号: TQ421.12

页码: 402-413

总页数: 12

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