山核桃GH3家族基因的功能初步研究及其在嫁接过程中的表达分析

论文摘要

山核桃（Carya cathayensis Sarg.）为胡桃科（Juglandaceae）山核桃属（Carya Nutt.）的木本油料树种,是浙江西北部、安徽南部地区的特色经济树种,经济价值较高。嫁接技术的应用能有效缩短山核桃童期,矮化树体,同时有利于实现山核桃良种化栽培。早期研究发现生长素含量的动态变化在嫁接愈合过程中发挥着重要作用,GH3基因参与植物生长素稳态调节,但CcGH3基因调控山核桃嫁接成活的机理未见报道。本研究主要以山核桃嫁接苗为实验材料,克隆并分析了山核桃GH3家族基因的序列特征和表达模式;分析了CcGH3家族基因启动子顺式作用元件,并验证了CcGH3-1基因启动子诱导活性;通过异源转化拟南芥,初步验证了CcGH3基因的基本功能;分析了CcGH3家族基因在山核桃嫁接过程中的表达模式。主要研究结果如下:（1）共克隆获得了12个山核桃GH3基因全长CDS序列;CcGH3家族蛋白有较高的保守性,尤其是ATP/AMP依赖的酰基化活性位点,暗示该家族有较强的腺苷化及氨基化酶学活性;CcGH3蛋白与木本植物中的同源蛋白有更近的亲缘关系;除GH3-x外,其他CcGH3蛋白均定位于细胞质中;CcGH3-x基因显示出与其他成员有较远的亲缘关系和不同的亚细胞定位特性。（2）CcGH3家族基因在根和叶中有着较高的表达量,而在茎中的表达量较低;生长素、水杨酸、激动素和脱落酸能诱导亚家族II中的CcGH3基因的表达量显著上升,而在乙烯利、赤霉素和茉莉酸甲酯的诱导下有8个CcGH3基因的表达量显著下降。值得注意的是,亚家族I和IV中4个成员表达模式相近,在所有激素诱导下主要呈现下调表达趋势。（3）在CcGH3家族基因启动子上分布有与生长素、乙烯、脱落酸、水杨酸、赤霉素和茉莉酸甲酯相关的顺式作用元件。在吲哚乙酸和萘乙酸诱导下,CcGH3-1基因启动子的诱导活性增强了1倍以上,暗示生长素在CcGH3-1基因的表达调控中发挥着重要作用;CcGH3-1基因启动子的诱导活性与长度有关,其中启动子-2000至-1501bp区域内可能存在着抑制表达的响应元件,而-500至-200bp范围是该基因的基本诱导序列。（4）CcGH3-1过表达拟南芥株系表现出叶片变小、株高变小、果荚变短等性状,而CcGH3-6a的过表达株系与野生型的表型差异较小。过表达株系中,拟南芥GH3、ILR/ILL、PIN家族多个成员的表达量受到显著抑制,而多个YUC基因的表达量显著上调,暗示山核桃GH3基因在生长素稳态调节中发挥着重要作用。（5）在山核桃嫁接愈合过程中,多数CcGH3基因在砧穂中呈先下降后上升的表达趋势,在嫁接3 d和7 d时维持低水平的表达,普遍仅为嫁接前的10%至40%,最低在10%以下;到嫁接后14 d和30 d时表达量又普遍回升,特别是CcGH3-3、CcGH3-4和CcGH3-10的表达量升高至嫁接0 d的10倍以上。砧穂中内源生长素含量在嫁接后3 d显著下降,仅为嫁接0 d时的8.8%和5.5%,嫁接后的7 d和14 d持续上升,嫁接后30 d恢复至嫁接前的82.5%和152.3%。山核桃嫁接过程中CcGH3家族基因表达量的变化可能是嫁接愈合过程中生长素含量变化的重要原因之一。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 本文缩略词
• 引言
• 1 文献综述
•   1.1 嫁接概述与山核桃嫁接研究进展
•     1.1.1 植物嫁接概述
•     1.1.2 山核桃嫁接研究进展
•     1.1.3 生长素对嫁接的影响
•   1.2 植物GH3基因研究进展
•     1.2.1 GH3基因的分类
•     1.2.2 GH3蛋白的结构
•     1.2.3 GH3基因的功能与调控
•       1.2.3.1 GH3基因参与生长素的稳态调控
•       1.2.3.2 GH3基因参与植物的胁迫响应
•       1.2.3.3 GH3基因的表达调控
•   1.3 本研究的目的与意义
• 2 山核桃GH3基因的克隆和生物信息学分析
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 实验材料
•       2.1.1.1 植物材料
•       2.1.1.2 试剂和仪器
•     2.1.2 实验方法
•       2.1.2.1 山核桃叶片总RNA提取
•       3.1.2.2 RACE cDNA的合成
•       2.1.2.3 山核桃GH3基因搜索及引物设计
•       2.1.2.4 GH3基因全长扩增
•       2.1.2.5 3’端GH3基因扩增
•       2.1.2.6 克隆片段的载体连接
•       2.1.2.7 转化大肠杆菌感受态
•       2.1.2.8 菌检和测序
•       2.1.2.9 山核桃GH3基因生物信息学分析
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 山核桃叶片总RNA的提取
•     2.2.2 山核桃GH3基因克隆
•       2.2.2.1 基因末端克隆
•       2.2.2.2 基因全长克隆
•     2.2.3 山核桃GH3基因序列分析
•       2.2.3.1 山核桃GH3蛋白理化性质及结构分析
•       2.2.3.2 山核桃GH3蛋白的同源性及进化分析
•   2.3 讨论
•   2.4 小结
• 3 山核桃GH3基因的表达模式分析
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 实验材料及处理
•       3.1.1.1 植物材料
•       3.1.1.2 试剂和仪器
•     3.1.2 实验方法
•       3.1.2.1 山核桃不同组织及激素诱导叶片的总RNA提取
•       3.1.2.2 cDNA的合成
•       3.1.2.3 定量引物设计
•       3.1.2.4 荧光定量PCR
•       3.1.2.5 数据处理
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 山核桃不同组织器官的总RNA
•     3.2.2 激素诱导山核桃叶片RNA提取
•     3.2.3 山核桃GH3基因在不同组织中的表达
•     3.2.4 不同植物激素对山核桃GH3基因的诱导
•   3.3 讨论
•   3.4 小结
• 4 山核桃GH3家族基因启动子分析
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 实验材料
•       4.1.1.1 植物材料
•       4.1.1.2 试剂和仪器
•     4.1.2 实验方法
•       4.1.2.1 山核桃叶片DNA提取
•       4.1.2.2 启动子的搜索及引物设计
•       4.1.2.3 启动子片段克隆
•       4.1.2.4 CcGH3p::GUS载体构建
•       4.1.2.5 转化农杆菌感受态
•       4.1.2.6 农杆菌瞬时转化烟草叶片
•       4.1.2.7 GUS组织化学染色
•       4.1.2.8 荧光法测定GUS酶活性
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 CcGH3-1启动子克隆与分析
•       4.2.1.1 CcGH3-1启动子序列克隆
•       4.2.1.2 CcGH3-1基因启动子生物信息学分析
•     4.2.2 山核桃GH3家族启动子激素相关顺式作用元件鉴定
•     4.2.3 CcGH3-1启动子活性分析
•       4.2.3.1 不同长度启动子CcGH3-1p::GUS表达载体构建
•       4.2.3.2 BSA标准曲线的绘制
•       4.2.3.3 4-MU荧光定量标准曲线的绘制
•       4.2.3.4 不同长度CcGH3-1启动子的GUS酶表达活性
•       4.2.3.5 植物激素诱导下CcGH3-1启动子的GUS酶表达活性
•   4.3 讨论
•   4.4 小结
• 5 山核桃GH3-1和CcGH3-6a在拟南芥中功能验证
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 实验材料
•       5.1.1.1 植物材料
•       5.1.1.2 试剂及仪器
•     5.1.2 实验方法
•       5.1.2.1 拟南芥的种植与培养
•       5.1.2.2 35S::CcGH3:GFP载体构建
•       5.1.2.3 转化拟南芥
•       5.1.2.4 过表达拟南芥抗性筛选
•       5.1.2.5 过表达拟南芥的PCR鉴定与荧光观察
•       5.1.2.6 过表达拟南芥中生长素代谢通路基因的表达分析
•   5.2 结果与分析
•     5.2.1 35S::CcGH3:GFP过表达载体构建
•       5.2.1.1 35S::CcGH3-1:GFP表达载体构建
•       5.2.1.2 35S::CcGH3-6a:GFP表达载体构建
•     5.2.2 过表达CcGH3拟南芥植株的鉴定
•     5.2.3 过表达CcGH3拟南芥植株的表型分析
•     5.2.4 生长素代谢通路基因在拟南芥过表达株系中的表达变化
•       5.2.4.1 过表达CcGH3拟南芥中AtGH3基因的表达
•       5.2.4.2 过表达CcGH3拟南芥中AtILL基因的表达
•       5.2.4.3 过表达CcGH3拟南芥中AtPIN和 AtAUX1/LAX基因的表达
•       5.2.4.4 过表达CcGH3拟南芥中AtYUC基因的表达
•   5.3 讨论
•   5.4 小结
• 6 山核桃GH3家族基因在嫁接愈合过程中的表达变化
•   6.1 材料与方法
•     6.1.1 实验材料
•       6.1.1.1 山核桃嫁接苗
•       6.1.1.2 试剂及仪器
•     6.1.2 实验方法
•       6.1.2.1 嫁接山核桃砧木和接穗部位总RNA提取
•       6.1.2.2 cDNA的合成
•       6.1.2.3 定量引物设计
•       6.1.2.4 荧光定量PCR及数据分析
•       6.1.2.5 游离IAA含量的测定
•   6.2 结果与分析
•     6.2.1 山核桃嫁接部位总RNA的提取
•     6.2.2 CcGH3基因在山核桃嫁接过程中的表达分析
•       6.2.2.1 CcGH3基因在嫁接过程中的表达
•       6.2.2.2 嫁接过程中激素对CcGH3基因表达的影响
•     6.2.3 嫁接过程中游离IAA的含量变化分析
•       6.2.3.1 IAA的标准曲线与方程
•       6.2.3.2 嫁接部位IAA的含量变化
•   6.3 讨论
•   6.4 小结
• 7 结论与展望
•   7.1 结论
•   7.2 展望
• 参考文献
• 附录
•   Ⅰ 常用试剂配方
•   Ⅱ 拟南芥、杨树、巨桉GH3基因的登录号
•   Ⅲ 拟南芥定量引物序列
• 个人简介
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 徐栋斌

导师: 郑炳松

关键词: 生长素,山核桃,嫁接,基因

来源: 浙江农林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,园艺

单位: 浙江农林大学

分类号: Q943.2;S664.1

总页数: 101

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