CD8+T细胞抗病毒与抗细菌感染功能调节机制研究

论文摘要

第一部分:Calcineurin-DAPK1-TSC2 信号通路介导 mTORC1活化调节CD8+T细胞抗感染功能蛋白,分别用Flag和HA的免疫沉淀抗体沉淀并纯化蛋白,免疫印记检测293T细胞中DAPK1与Calcineurin是否结合。研究目的:CD8+T细胞在机体抗感染免疫、自身免疫和抗肿瘤免疫中起到重要作用。初始CD8+T细胞在MHC I类分子提呈的抗原刺激下,由静息状态分化为抗原特异杀伤效应细胞,并迁移至外周组织发挥其杀伤功能。CD8+T细胞的杀伤功能受到许多因素调节。mTOR（mechanistic target of Rapamycin雷帕霉素靶蛋白）信号通路在T细胞的生长发育与活化分化,增殖凋亡与代谢中起重要作用。DAPK1是一种钙离子-钙调蛋白调节的丝/苏氨酸蛋白激酶,已有研究显示,DAPK1通过其死亡结构域可与mTORC1上游抑制分子TSC2结合,使TSC1-TSC2复合物解聚,从而促进mTORC1活性。但目前对DAPK1如何活化,以及在免疫细胞中的功能了解有限。本研究旨在探索DAPK1在CD8+T细胞中如何活化,是否可以通过调节mTORC1通路影响CD8+T细胞的功能,从而影响机体的抗感染能力。研究方法:一、Calcineurin活化DAPK1的机制研究1.Calcineurin抑制剂对TCR诱导的CD8+T细胞DAPK1活性的抑制作用检测:分离野生型小鼠的脾脏,裂解红细胞后制成单细胞悬液,用0.5μg/ml anti-CD3抗体培养48h后,再用20ng/ml IL-2扩增培养6天,分化为细胞毒性CD8+T（CTL）细胞。该细胞用无血清的1640培养基饥饿细胞12h,再用2μg/ml anti-CD3/CD28抗体及Calcineurin抑制剂（2μM FK506）和DAPK1抑制剂（2μM DAPK1i）共同作用1h后,收集细胞样品,提取蛋白,免疫印迹检测NFAT信号通路及DAPK1的活性改变。2.Calcineurin与DAPK1的免疫共沉淀检测:培养HEK 293T细胞,向293T细胞中转入DAPK1-Flag和Calcineurin-HA的质粒,培养36h后,收集细胞样品,提取3.Calcineurin与DAPK1的免疫荧光共定位检测:分离野生型小鼠脾脏,裂解红细胞制成单细胞悬液,用0.5μg/ml anti-CD3抗体培养48h后,再用20ng/ml IL-2扩增培养6天,分化为CTL细胞,用无血清的1640培养基饥饿细胞12h,不加刺激或用2μg/ml anti-CD3/CD28抗体作用1h,收集细胞样品,固定,破膜,染色,共聚焦荧光显微镜检测Calcineurin与DAPK1在CD8+T细胞中的共定位情况。4.Calcineurin与DAPK1的不同结构域的结合的检测:培养HEK 293T细胞,向HEK 293T细胞中转入标记Flag标签的DAPK1不同结构域的截短体（ΔCaM,ΔKD,△DD）和Calcineurin-HA的质粒,培养36h后,收集细胞样品,提取蛋白,分别用Flag和HA的免疫沉淀抗体沉淀蛋白,免疫印记检测HEK 293T细胞中DAPK1的不同截短体与Calcineurin是否共沉淀。二、DAPK1调控TSC2的机制研究TSC2与DAPK1的免疫荧光共定位的检测:分离野生型小鼠的脾脏,裂解红细胞制成单细胞悬液,用0.5μg/ml anti-CD3抗体培养48h后,再用20ng/ml IL-2扩增培养6天,分化为CTL细胞,不加刺激或用2μg/ml anti-CD3/CD28抗体刺激1h,收集细胞样品,固定,染色,共聚焦荧光显微镜检测TSC2与DAPK1在CD8+T细胞中的共定位情况。三、Calcineurin和DAPK1对mTORC1通路活性的影响研究1.Calcineurin和DAPK1抑制剂对CD8+T细胞的mTORC1活性的影响检测:分离野生型小鼠脾脏,裂解红细胞制成单细胞悬液,用0.5μg/ml anti-CD3抗体和T细胞培养基培养48h后,再用20ng/ml IL-2扩增培养6天,分化为CTL细胞,用2μg/ml anti-CD3/CD28 及不同浓度 Calcineurin 抑制剂（2μM FK506,500nM Cyclosporin A）和DAPK1抑制剂（2μM DAPK1i）共同作用1h后,收集细胞样品,提取蛋白,免疫印迹检测mTORC1下游效应底物核糖体蛋白S6和P70S6K的磷酸化蛋白和总蛋白的表达。2.Calcineurin和DAPK1 shRNA对CD8+T细胞的mTORC1活性的影响检测:分离野生型小鼠脾脏,裂解红细胞后制成单细胞悬液,用抗生物素抗体标记的磁珠和生物素标记的抗CD8分子的抗体阳性选择分离出CD8+T细胞,用5μg/ml anti-CD3/CD28抗体和T细胞培养基培养24h后,将Calcineurin shRNA逆转录病毒,DAPK1 shRNA逆转录病毒和空白载体分别转染到CD8+T细胞中,继续培养24h后,用20ng/ml IL-2重新刺激60min,收集细胞,流式染色并检测mTORC1下游效应底物核糖体蛋白S6的磷酸化含量。3.DAPK1-KD 敲除小鼠（CD4-Cre;DAPK1-KDfl/fl）CD8+T 细胞中 mTORC1 活性改变检测:分离野生型和DAPK1-KD敲除小鼠脾脏,裂解红细胞后制成单细胞悬液,用2μg/ml anti-CD3/CD28抗体以及T细胞培养基培养0,15,30,60min,在不同的时间点流式检测CD8+T细胞中mTORC1下游效应底物核糖体蛋白S6的磷酸化含量改变。4.DAPK1-DD 敲除小鼠（CD4-Cre;DAPK1-DDfl/fl）的 CD8+T 细胞中 mTORC1活性改变检测:分离野生型和DAPK1-DD敲除小鼠脾脏,裂解红细胞制成单细胞悬液,用2μg/ml anti-CD3/CD28抗体以及T细胞培养基培养0,15,30,60min,在不同的时间点流式检测CD8+T细胞中mTORC1下游效应底物核糖体蛋白S6的磷酸化改变。四、DAPK1 对 TCR 或 IL-2 诱导的 PLC-γ,Erk,MAPK,NF-κB 和 STAT5 信号通路影响的研究1.DAPK1-KD 敲除小鼠 CD8+T 细胞中 TCR 或 IL-2 诱导的 PLC-γ,Erk,MAPK,NF-κB和STAT5信号通路的活性检测:分离野生型和DAPK1-KD敲除小鼠的脾脏,裂解红细胞制成单细胞悬液,用0.5μg/ml anti-CD3抗体培养48h后,再用20ng/ml IL-2扩增培养6天,分化为CTL细胞,无血清1640培养基饥饿细胞12h,用含2μg/ml anti-CD3/CD28抗体或者20ng/ml IL-2的T细胞培养基再培养60min,收集细胞样品,提取蛋白,免疫印迹检测PLC-γ,Erk,MAPK,NF-κB和STAT5通路的活化情况,检测PLC-γ,Erk,p38,p65和STAT5的总蛋白和磷酸化蛋白的表达。2.DAPK1-DD 敲除小鼠的 CD8+T 细胞中 TCR 或 IL-2 诱导的 PLC-γ,Erk,MAPK,NF-κB和STAT5信号通路的活性检测:分离野生型和DAPK1-DD敲除小鼠的脾脏,裂解红细胞制成单细胞悬液,用0.5μg/ml anti-CD3抗体培养48h后,再用20ng/ml IL-2扩增培养6天,分化为CTL细胞,无血清1640培养基饥饿12h,用2μg/ml anti-CD3/CD28抗体或者20ng/ml IL-2的T细胞培养基再培养60min,收集细胞样品,提取蛋白,免疫印迹检测PLC-γ,Erk,MAPK,NF-κB和STAT5通路的活化情况,检测PLC-γ,Erk,p38,p65和STAT5的总蛋白和磷酸化蛋白的表达。五、DAPK1对急性脑膜炎脉络丛病毒感染（LCMV）模型小鼠中CD8+T细胞的功能影响1.急性病毒感染（LCMV）小鼠模型的建立:给予野生型和DAPK1-KD敲除小鼠腹腔注射2×105 PFU LCMV-Armstrong病毒液,病毒感染小鼠不同时间。2.DAPK1对急性病毒感染小鼠模型中CD8+T细胞mTORC1活性影响的检测:在LCMV病毒感染后的第3,5和8天,处死小鼠,取小鼠脾脏裂解红细胞制成单细胞悬液,流式染色并检测活化CD8+T（CD44+CD8）细胞中mTORC1下游效应底物核糖体蛋白S6的磷酸化表达。3.DAPK1对急性病毒感染小鼠模型中CD8+T细胞增殖与凋亡能力的影响的检测:（1）在LCMV病毒感染后的第8天和第30天,处死小鼠,取小鼠脾脏裂解红细胞制成单细胞悬液,流式染色并检测总的CD8+T细胞以及活化CD8+T细胞的比例和数目以及活化CD8+T细胞中Ki-67,Annexin V和PI的表达。（2）在LCMV病毒感染后的第8天,处死小鼠,取小鼠脾脏裂解红细胞制成单细胞悬液,磁珠纯化活化的CD8+T细胞,提取RNA,实时定量PCR检测抗凋亡分子Bcl-2的mRNA的表达。4.DAPK1对急性病毒感染小鼠模型中CD8+T细胞效应功能影响的检测:（1）在LCMV病毒感染后的第8天,处死小鼠,取小鼠脾脏裂解红细胞制成单细胞悬液,流式染色并检测活化CD8+T细胞的IL-2,TNF-α,IFN-γ,Granzyme B和T-bet的表达。（2）在LCMV病毒感染后的第8天,处死小鼠,取小鼠脾脏裂解红细胞制成单细胞悬液,磁珠纯化活化的CD8+T细胞,提取RNA,定量PCR检测Granzyme B,Granzyme K,Ifng,Tbx21和Klrg1的 mRNA 的表达。5.DAPK1对急性病毒感染小鼠模型中CD8+T细胞分化的影响的检测:（1）在LCMV病毒感染后的第8天和第30天,处死小鼠,取小鼠脾脏裂解红细胞制成单细胞悬液,流式染色活化CD8+T细胞中KLRG1和CD127分子表达,并检测终末效应（TE）CD8+T细胞和记忆前体（MP）CD8+T细胞的比例与数目。（2）在LCMV病毒感染后的第8天和第30天,处死小鼠,取小鼠脾脏裂解红细胞制成单细胞悬液,流式染色并检测活化CD8+T细胞中记忆相关表面分子CD127,CXCR3和转录因子TCF-1,Eomes的表达。6.DAPK1对急性病毒感染小鼠模型中CD8+T细胞糖代谢功能的影响的检测:（1）在LCMV病毒感染后的第8天和第30天,处死小鼠,取小鼠脾脏裂解红细胞制成单细胞悬液,用含有2-NBDG的T细胞培养基培养细胞2h后,流式染色活化CD8+T细胞中2-NBDG的表达,检测CD8+T细胞的糖摄取能力。（2）在LCMV病毒感染后的第8天,处死小鼠,取小鼠脾脏裂解红细胞制成单细胞悬液,磁珠纯化活化的CD8+T细胞,提取RNA,定量PCR检测活化CD8+T细胞中糖酵解相关分子Eno1,Hif1α,Ldha,Pdk1,Scl2a,Tpi1,Pfkm,Pgk1以及有氧糖代谢分子Atp5i,Cox5a,Ndufa2,Nrf1的mRNA的表达。7.DAPK1对急性病毒感染小鼠模型中CD8+T细胞清除病毒的能力影响的检测:在LCMV病毒感染后的第5天,处死小鼠,取小鼠血清,脾脏,肝脏和肺组织,研磨匀浆,提取血清及组织病毒RNA,定量PCR检测血清及组织中病毒滴度。六、DAPK1对急性病毒感染（LCMV）小鼠模型中抗原特异性CD8+T细胞功能影响的检测1.急性病毒感染（LCMV）小鼠的过继免疫模型建立:从WT P14（CD45.2）和CD4-Cre;P14;DAPK1-KDfl/fl（CD45.2）小鼠的脾脏中分离纯化出 P14 CD8+T 细胞,以CD45.1 WT小鼠作为受体小鼠,将5×105WT（CD45.2）P14 CD8+T细胞或DAPK1-KDfl/fl（CD45.2）P14 CD8+T细胞尾静脉注射到受体小鼠体内,16h后,腹腔注射2×105 PFU LCMV Armstrong病毒到受体小鼠体内。2.DAPK1对急性病毒感染小鼠模型中抗原特异性CD8+T细胞增殖与凋亡能力影响的检测:在感染病毒后第8天,处死受体小鼠,取小鼠脾脏裂解红细胞制成单细胞悬液,流式染色并检测不同来源的P14 CD8+T细胞在受体小鼠中的比例和数目,以及P14 CD8+T细胞中Ki-67,Annexin V和PI的表达。3.DAPK1对急性病毒感染小鼠模型中抗原特异性CD8+T细胞效应功能影响的检测:在感染病毒后第8天,处死受体小鼠,取小鼠脾脏裂解红细胞制成单细胞悬液,流式染色并检测不同来源的P14 CD8+T细胞中Granzyme B,IFN-γ,T-bet,KLRG1和CD 127的表达。4.DAPK1对急性病毒感染小鼠模型中抗原特异性CD8+T细胞分化的影响的检测:在感染病毒后第8天,处死受体小鼠,取小鼠脾脏裂解红细胞制成单细胞悬液,流式染色并检测不同来源的P14 CD8+T细胞中记忆相关表面分子CD127,CXCR3和转录因子TCF-1的表达。七、DAPK1敲除的机体环境对急性病毒感染小鼠模型中抗原特异性的CD8+T细胞功能影响的研究1.急性病毒感染（LCMV）小鼠的外源性过继免疫模型建立:从WT P14（CD45.1+CD45.2+）小鼠的脾脏中分离出P14 CD8+T细胞,以CD45.1 WT小鼠和CD4-Cre;P14;DAPK1-KDfl/fl（CD45.2）小鼠作为受体小鼠,尾静脉注射 5×105WT P14 CD8（CD45.1+CD45.2+）T 细胞到受体小鼠,16h 后,腹腔注射 2×105 PFU LCMV Armstrong病毒感染受体小鼠。2.DAPK1敲除的机体环境对急性病毒感染小鼠模型中抗原特异性的CD8+T细胞增殖与凋亡能力影响的检测:在感染病毒后第八天,处死受体小鼠,取小鼠脾脏裂解红细胞制成单细胞悬液,流式染色并检测不同受体小鼠中P14 CD8+T细胞的比例,数目以及Ki-67,Annexin V和PI的表达3.DAPK1敲除的机体环境对急性病毒感染小鼠模型中抗原特异性的CD8+T细胞效应功能的影响的检测:在感染病毒后第八天,处死受体小鼠,取小鼠脾脏裂解红细胞制成单细胞悬液,流式染色并检测不同受体小鼠中P14 CD8+T细胞的Granzyme B的表达。研究结果:1.Calcineurin活化DAPK1的机制:Calcineurin可以与DAPK1的钙调蛋白区（CaM）相结合,在TCR的诱导下,Calcineurin与DAPK1的结合增加,从而促使DAPK1的活化增加。2.DAPK1调控TSC2的机制:DAPK1与TSC2相结合,在TCR的诱导下,DAPK1和TSC2的结合增加。3.Calcineurin和DAPK1对mTORC1通路活性的影响:在CD8+T细胞中,Calcineurin和DAPK1都可以调控mTORC1的活性。当在小鼠的CD8+T细胞中特异性敲除DAPK1的激酶区（KD）和死亡结构域（DD）时,mTORC1的活性均降低。4.DAPK1 对 TCR 或 IL-2 诱导的 PLC-γ,Erk,MAPK,NF-κB 和 STAT5 等信号通路的影响:免疫印迹结果显示,CD8+T细胞中,DAPK1对TCR和IL-2诱导的PLC-γ,Erk,MAPK,NF-κB和STAT5信号通路的活性无影响。5.DAPK1对急性病毒感染（LCMV）小鼠模型中CD8+T细胞的功能影响:在急性病毒感染（LCMV）小鼠模型中,敲除DAPK1将导致CD8+T细胞的mTORC1的活性降低,细胞增殖降低,凋亡增加;CD8+T细胞的效应功能减弱,向记忆前体细胞分化的能力减弱;CD8+T细胞的糖代谢能力降低,清除病毒的能力受损。6.DAPK1对急性病毒感染（LCMV）小鼠模型中抗原特异性CD8+T细胞的功能影响:在急性病毒感染（LCMV）小鼠模型中,敲除DAPK1将导致抗原特异性CD8+T细胞的增殖降低,凋亡增加;效应功能减弱,向记忆前体细胞分化的能力减弱。7.DAPK1敲除的机体环境对急性病毒感染小鼠模型中抗原特异性的CD8+T细胞功能的影响:在急性病毒感染（LCMV）小鼠模型中,DAPK1敲除的机体环境对抗原特异性的CD8+T细胞的增殖,凋亡以及效应功能均无影响。研究结论:1.Cacineurin与DAPK1的钙调蛋白区（CaM）结合,在TCR的诱导下活化DAPK1。2.DAPK1的死亡结构域（DD）与TSC2相结合,抑制TSC1/TSC2复合体的形成,活化mTORC1信号通路。3.敲除DAPK1导致CD8+T细胞在急性病毒感染中的抗病毒感染功能降低。第二部分 α-半乳糖阻断Tim-3介导的CD8+T细胞凋亡并逆转脓毒症中肝脏损伤研究目的:脓毒症是一种致死率很高的临床感染性疾病。在发病初期会出现强烈的炎症反应,并引发后续的免疫抑制,危及到机体的多个器官功能,导致病程的进一步加重。在脓毒症发病过程中,多种免疫细胞高表达Tim-3（T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3）,Tim-3与其配体Galactin-9（半乳糖凝集素-9）结合后进一步诱导免疫细胞凋亡,从而导致免疫抑制的发生。肝脏作为重要的免疫调节器官,在免疫应答活化后主要负责清除凋亡的免疫细胞,但同时肝脏也是脓毒症中免疫损伤的主要靶器官。在感染疾病中,增强CD8+T细胞的杀伤功能可以遏制并清除感染,但CD8+T细胞在脓毒症中的肝脏免疫应答尚不清楚。本研究目的在于阐明脓毒症中主要靶器官肝脏CD8+T细胞的免疫反应,并尝试用Galactin-9配体抑制剂α-半乳糖阻断CD8+T细胞的凋亡,增强CD8+T细胞的抗感染能力,进而改善脓毒症患者病程。研究方法:一、脓毒症患者外周血中CD8+T细胞的功能改变研究外周血CD8+T细胞的Tim-3和Annexin V的表达检测:收集健康志愿者（n=20）和脓毒症患者（n=35）的外周血,用人的外周血淋巴细胞分离液分离其中的淋巴细胞,染色CD8,Tim-3和Annexin V,再用流式细胞仪检测其表达。二、脓毒症模型小鼠的CD8+T细胞的功能改变研究1.脓毒症（CLP）小鼠模型的构建:麻醉正常健康的野生型小鼠,将小鼠呈仰卧位固定,清理小鼠下腹部毛发并消毒,剪开腹腔,取出盲肠并结扎穿孔后放回,缝合腹腔,复苏小鼠,诱导小鼠发生脓毒症反应。对照组（Sham）小鼠同样剪开腹腔,之后再缝合,对盲肠不做任何处理,其余处理方法与实验组一致。在手术后的不同时间点,处死小鼠,进行后续实验。2.脾脏的淋巴细胞的分离:处死小鼠,取脾脏,剪碎并研磨过滤,制作成单细胞悬液。离心后加入红细胞裂解液裂解细胞团块,除去红细胞。剩余细胞即为淋巴细胞,用1×PBS重悬后备用。3.肝脏的淋巴细胞的分离:处死小鼠,取肝脏,剪碎并研磨过滤,制作成单细胞悬液,离心后用33.75%Percoll重悬细胞,再离心去除肝细胞,分离纯化淋巴细胞。加入红细胞裂解液裂解分离出的淋巴细胞,除去红细胞。剩余细胞即为纯化后的淋巴细胞,用1×PBS重悬后备用。4.小鼠脾脏和肝脏CD8+T细胞的Tim-3的表达检测:分离不同时间点的脓毒症实验组和对照组小鼠的脾脏和肝脏淋巴细胞,各取1×106的细胞用于流式染色,分别染色CD8和Tim-3流式抗体,再用流式细胞仪检测其表达。三、脓毒症模型小鼠的脾脏和肝脏CD8+T细胞的凋亡研究1.脓毒症模型小鼠的脾脏和肝脏CD8+T细胞的Annexin V的表达检测:取1×106的脾脏和肝脏淋巴细胞用于流式染色,分别染色CD8和Annexin V,再用流式细胞仪检测其表达。2.Tim-3突变（Tim-3mut）小鼠的构建:Tim-3突变小鼠是选择C57BL/6背景的小鼠,突变其编码Tim-3分子胞质区的末端h21883位置的染色体位点来构建该小鼠。3.脓毒症模型Tim-3突变小鼠的肝脏CD8+T细胞的Annexin V的表达检测:取1×106的肝脏淋巴细胞用于流式染色,分别染色CD8和Annexin V,再用流式细胞仪检测其表达。四、α-半乳糖对于脓毒症小鼠受损肝脏的保护作用的研究1.α-半乳糖对于脓毒症小鼠肝脏CD8+T细胞的Tim-3的表达影响的检测:给予脓毒症模型小鼠腹腔注射1×PBS或者α-半乳糖,在不同时间点处死小鼠,取肝脏,分离肝脏淋巴细胞,分别染色CD8和Tim-3,再用流式细胞仪检测其表达。2.α-半乳糖对于脓毒症小鼠肝脏的病理组织影响检测:给予脓毒症模型小鼠腹腔注射1×PBS或者α-半乳糖,在不同时间点处死小鼠,取肝脏,固定并切片,免疫组化染色,在荧光显微镜下拍摄肝脏组织病理图片。3.α-半乳糖对于脓毒症小鼠肝脏的功能影响检测:给予脓毒症模型小鼠腹腔注射1×PBS或者α-半乳糖,在不同时间点处死小鼠,眼球取血,分离血清,分别用ALT和AST试剂盒检测血清中ALT和AST的表达水平。4.α-半乳糖对于脓毒症小鼠肝脏的炎症因子表达的影响检测:给予脓毒症模型小鼠腹腔注射1×PBS或者α-半乳糖,24h后处死小鼠,分离小鼠肝脏,用匀浆仪将肝脏制成匀浆,用Tizol提取肝脏组织RNA,用定量PCR检测法检测肝脏组织中Il-6,Il-23,Il-2 7 和 Tnfα的 mRNA 表达。研究结果:1.脓毒症患者外周血CD8+T细胞中Tim-3与Annexin V的表达:与正常志愿者相比,脓毒症患者的外周血CD8+T细胞高表达Tim-3和Annexin V。此外,在脓毒症患者外周血中,Annexin V+CD8+T细胞表达更多的Tim-3。2.脓毒症模型（CLP）小鼠的脾脏CD8+T细胞的Tim-3表达:与对照组（Sham）小鼠相比,脓毒症模型小鼠的脾脏CD8+T细胞的Tim-3表达没有差异。3.脓毒症模型（CLP）小鼠的肝脏CD8+T细胞的Tim-3表达:与对照组（Sham）小鼠相比,脓毒症模型小鼠的肝脏CD8+T细胞的Tim-3表达随着时间变化呈双相性升高。4.脓毒症模型（CLP）小鼠的脾脏CD8+T细胞的Annexin V表达:与对照组（Sham）小鼠相比,脓毒症模型小鼠的脾脏CD8+T细胞的Annexin V表达没有差异。5.脓毒症模型（CLP）小鼠的肝脏CD8+T细胞的Annexin V表达:与对照组（Sham）小鼠相比,脓毒症模型小鼠的肝脏CD8+T细胞的Annexin V表达随着时间变化先升高再降低。6.脓毒症模型（CLP）Tim-3突变小鼠的肝脏CD8+T细胞的Annexin V表达:与对照组正常野生型脓毒症模型小鼠相比,Tim-3突变脓毒症模型小鼠的肝脏CD8+T细胞的Annexin V表达明显降低。7.α-半乳糖对脓毒症模型（CLP）小鼠的肝脏CD8+T细胞的Tim-3表达的影响:与对照组经腹腔注射PBS的脓毒症模型小鼠相比,实验组经腹腔注射α-半乳糖的脓毒症模型小鼠肝脏CD8+T细胞中的Tim-3表达明显降低。8.α-半乳糖对脓毒症模型（CLP）小鼠的肝脏的功能影响:与对照组经腹腔注射1×PBS的脓毒症模型小鼠相比,实验组经腹腔注射α-半乳糖的脓毒症模型小鼠肝脏的损伤和肝小叶炎症明显降低,肝细胞坏死更少。9.α-半乳糖对脓毒症模型（CLP）小鼠肝脏的炎症因子的表达影响:与对照组经腹腔注射1×PBS的脓毒症模型小鼠相比,实验组经腹腔注射α-半乳糖的脓毒症模型小鼠肝脏的炎症因子IL-23,IL-27,TNF-α的表达都明显降低,IL-6的表达无变化。研究结论:1.在脓毒症患者的外周血中,CD8+T细胞Tim-3的表达升高与细胞凋亡相关。2.在脓毒症模型小鼠的肝脏CD8+T细胞中,Tim-3的表达随着时间变化呈现双相性增加。3.在脓毒症模型小鼠的肝脏中,Tim-3介导CD8+T细胞的凋亡。4.α-半乳糖可以降低脓毒症模型小鼠的肝脏损伤。

论文目录

• 中英文缩略词汇表
• +T 细胞抗感染功能'>第一部分:Calcineurin-DAPK1-TSC2信号通路介导mTORC1活化调控CD8⁺T 细胞抗感染功能
•   摘要
•   Abstract
•   前言
•   实验材料与方法
•   实验结果
•   小结
•   结论
•   讨论
• +T 细胞凋亡并逆转脓毒症中肝脏损伤'>第二部分:α-半乳糖阻断Tim-3 介导的CD8⁺T 细胞凋亡并逆转脓毒症中肝脏损伤
•   摘要
•   Abstract
•   前言
•   实验材料与方法
•   实验结果
•   小结
•   结论
•   讨论
• + T 细胞的抗感染免疫反应'>综述 CD8⁺ T 细胞的抗感染免疫反应
• 参考文献
• 附录 攻读学位期间发表文章
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 魏正萍

导师: 杨想平

关键词: 病毒感染,细胞,脓毒症,肝脏损伤,凋亡

来源: 华中科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 华中科技大学

分类号: R392

DOI: 10.27157/d.cnki.ghzku.2019.005099

总页数: 119

文件大小: 6547k