荧光假单胞菌及其噬菌体共进化过程中感染/抗感染基因变化研究

论文摘要

噬菌体与宿主之间复杂的相互作用在形成环境微生物群落结构中起着重要作用。细菌与噬菌体之间反复产生抗性与感染性的共进化过程称为拮抗共进化。细菌-噬菌体的拮抗共进化在种群动力学、进化多样性、基因重组等方面扮演重要角色。噬菌体感染宿主的第一步是吸附,在共进化过程中宿主对噬菌体吸附的抑制作用以及噬菌体对宿主吸附能力的增强,均导致了噬菌体吸附元件及细菌吸附受体的共进化多样性。本研究以纳帕海高原湿地水样分离得到的荧光假单胞菌W-6及其长尾噬菌体VW6S为材料,开展了宿主全基因组解析、共进化后、过程中宿主抗感染基因、噬菌体感染基因变化、宿主吸附受体以及噬菌体吸附元件确定等研究。W-6全基因组长度6,109,123 bp,G+C含量59.79%;共编码5,474个基因;具有74个重复序列,89个非编码RNA,24座基因岛以及2个CRISPR序列和4个spacer序列;还发现W-6含有前噬菌体,表明W-6是一株溶源菌。共进化过程中不同时期宿主重测序比对结果表明:共产生了254个碱基突变,涉及80个基因,其中吸附受体相关的突变占总突变数量的10%,而外膜蛋白的突变远多于LPS;甲基趋化蛋白突变占10%,这也许与限制修饰系统有关。PCR扩增实验也发现LPS相关基因几乎没有发生变化,而外膜蛋白发生明显变化,进一步证实外膜蛋白在吸附中的作用远大于LPS。进一步研究表明在共进化过程的后几个时期噬菌体将其整合酶基因整合在宿主基因组上。共进化过程中噬菌体基因组的变化主要产生在两个尾丝蛋白,尤其是尾丝蛋白GP28,而水解酶蛋白和穿孔素蛋白基本没有变化。体外活性探究实验表明尾丝蛋白GP28异源表达具有活性,并能与噬菌体竞争识别吸附受体。因此推测在噬菌体吸附宿主的过程中gp28可能是重要的吸附基因。本研究初步揭示了宿主-噬菌体相互作用过程中吸附元件与吸附受体的作用,同时阐述了共进化过程中宿主与噬菌体基因组的变化情况,为阐明噬菌体-宿主敌对共进化关系提供基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 荧光假单胞菌概述
•   1.2 噬菌体概述
•     1.2.1 噬菌体的定义
•     1.2.2 噬菌体的分类
•   1.3 基因组学研究
•   1.4 荧光假单胞菌基因组研究现状
•   1.5 噬菌体与细菌的攻防机制
•   1.6 共进化的定义及研究现状
•   1.7 研究意义
• 第二章 荧光假单胞菌W-6全基因组解析
•   2.1 材料
•   2.2 方法
•     2.2.1 基因组提取与测序
•       2.2.1.1 基因组提取
•       2.2.1.2 全基因组测序
•     2.2.2 基因组组分分析
•       2.2.2.1 基因组特性分析
•       2.2.2.2 编码基因预测
•       2.2.2.3 重复序列预测
•       2.2.2.4 非编码RNA预测
•       2.2.2.5 基因岛预测
•       2.2.2.6 CRISPR预测
•       2.2.2.7 其他基因元件预测
•     2.2.3 基因功能注释
•       2.2.3.1 COG功能注释
•       2.2.3.2 KEGG功能注释
•       2.2.3.3 GO功能注释
•       2.2.3.4 耐药基因注释
•       2.2.3.5 CAZy注释
•     2.2.4 基因组圈图
•     2.2.5 比较基因组分析
•   2.3 结果
•     2.3.1 荧光假单胞菌W-6 基因组分析
•       2.3.1.1 荧光假单胞菌W-6 基因组一般特性
•       2.3.1.2 编码基因预测结果
•       2.3.1.3 W-6 的重复序列预测结果
•       2.3.1.4 非编码RNA预测结果
•       2.3.1.5 W-6 基因岛预测结果
•       2.3.1.6 W-6CRISPR系统预测结果
•       2.3.1.7 W-6 其他基因组元件预测结果
•     2.3.2 荧光假单胞菌W-6 基因功能注释
•       2.3.2.1 W-6的COG注释
•       2.3.2.2 W-6的KEGG注释
•       2.3.2.3 W-6的GO注释
•       2.3.2.4 W-6 耐药基因注释
•       2.3.2.5 W-6的CAZy功能注释
•     2.3.3 荧光假单胞菌W-6 基因组圈图
•     2.3.4 荧光假单胞菌W-6 比较基因组学分析
•   2.4 讨论
• 第三章 共进化过程中宿主抗感染相关基因的变化
•   3.1 材料
•     3.1.1 实验菌株和噬菌体
•     3.1.2 菌株、质粒及培养基
•       3.1.2.1 菌株与质粒
•       3.1.2.2 培养基
•   3.2 方法
•     3.2.1 共进化过程
•       3.2.1.1 宿主与噬菌体的共进化
•       3.2.1.2 宿主单独进化
•     3.2.2 基因组重测序
•       3.2.2.1 基因组提取
•       3.2.2.2 重测序
•     3.2.3 重测序数据分析
•       3.2.3.1 共进化不同时期W-6 Variant检测
•       3.2.3.2 PCA分析
•       3.2.3.3 系统进化发育树
•       3.2.3.4 分子变异分析
•     3.2.4 抗感染相关基因PCR扩增
•       3.2.4.1 LPS相关基因PCR扩增
•       3.2.4.2 CRISPR基因PCR扩增
•       3.2.4.3 噬菌体整合酶gp21 基因PCR扩增
•     3.2.5 W-6 宿主菌吸附受体的鉴定
•       3.2.5.1 W-6 对蛋白酶K、醋酸钠以及高碘酸盐醋酸钠的耐受性检验
•       3.2.5.2 W-6 外膜蛋白在噬菌体吸附中的作用
•       3.2.5.3 W-6的LPS在噬菌体吸附中的作用
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 共进化不同时期W-6 重测序数据分析
•       3.3.1.1 共进化中基因组突变
•       3.3.1.2 共进化中吸附相关基因突变
•       3.3.1.3 经过共进化过程W-6 PCA分析
•       3.3.1.4 共进化不同时期W-6系统进化发育树
•       3.3.1.5 共进化过程中W-6 基因组的分子进化率
•     3.3.2 抗感染相关基因PCR验证
•       3.3.2.1 LPS相关基因PCR扩增结果
•       3.3.2.2 CRISPR基因PCR扩增结果
•       3.3.2.3 噬菌体整合酶基因PCR扩增结果
•     3.3.3 W-6 宿主菌吸附受体的鉴定
•       3.3.3.1 W-6 对蛋白酶K、醋酸钠以及高碘酸盐醋酸钠耐受
•       3.3.3.2 W-6 外膜蛋白在噬菌体吸附中的作用
•       3.3.3.3 W-6的LPS在噬菌体吸附中的作用
•   3.4 讨论
• 第四章 共进化过程噬菌体感染基因变化
•   4.1 材料
•     4.1.1 菌株与质粒
•     4.1.2 培养基
•   4.2 方法
•     4.2.1 共进化过程
•     4.2.2 重测序
•       4.2.2.1 基因组提取
•       4.2.2.2 基因组重测序
•     4.2.3 重测序数据分析
•       4.2.3.1 不同时期VW6S Variant检测
•       4.2.3.2 PCA分析
•       4.2.3.3 系统进化发育树
•     4.2.4 感染相关基因PCR扩增
•       4.2.4.1 尾丝蛋白GP27 的基因克隆
•       4.2.4.2 尾丝蛋白GP28 基因扩增
•       4.2.4.3 穿孔素蛋白holin基因扩增
•       4.2.4.4 水解酶蛋白endolysin基因扩增
•   4.3 结果
•     4.3.1 共进化不同时期VW6S重测序数据分析
•       4.3.1.1 共进化中的基因组突变
•       4.3.1.2 共进化不同时期VW6S PCA分析
•       4.3.1.3 共进化不同时期VW6S系统发育进化树
•     4.3.2 感染宿主相关基因体外克隆验证
•       4.3.2.1 尾丝蛋白GP27 的基因扩增及比对分析
•       4.3.2.2 尾丝蛋白GP28 基因扩增及比对分析
•       4.3.2.3 穿孔素蛋白基因扩增及比对分析
•       4.3.2.4 水解酶蛋白体外克隆体外克隆及比对分析
•   4.4 讨论
• 第五章 gp27、gp28 的异源表达
•   5.1 材料
•     5.1.1 菌株与质粒
•     5.1.2 培养基
•   5.2 方法
•     5.2.1 尾丝蛋白Gp27、GP28 克隆表达
•       5.2.1.1 尾丝蛋白GP27 克隆表达
•       5.2.1.2 尾丝蛋白GP28 克隆表达
•     5.2.2 尾丝蛋白GP27、GP28 重组蛋白体外活性探究
•       5.2.2.1 尾丝蛋白GP27 重组蛋白体外活性
•       5.2.2.2 尾丝蛋白GP28 重组蛋白体外活性
•   5.3 结果
•     5.3.1 尾丝蛋白GP27/GP28 克隆表达结果
•       5.3.1.1 重组尾丝蛋白GP27 基因克隆结果
•       5.3.1.2 尾丝蛋白GP28 异源表达及纯化结果
•     5.3.2 尾丝蛋白与噬菌体的竞争吸附
•       5.3.2.1 尾丝蛋白GP27 与噬菌体竞争吸附实验结果
•       5.3.2.2 尾丝蛋白GP28 与噬菌体竞争吸附实验结果
•   5.4 讨论
• 第六章 总结与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 共进化过程中荧光假单胞菌基因变化情况
• 附录B 实验常用试剂及仪器
• 附录C 攻读硕士期间发表论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王爽

导师: 季秀玲

关键词: 全基因组解析,长尾噬菌体,共进化,吸附受体,吸附元件

来源: 昆明理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 昆明理工大学

分类号: Q933

DOI: 10.27200/d.cnki.gkmlu.2019.000417

总页数: 141

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