导读:本文包含了淋巴囊肿病毒病论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:淋巴囊肿病毒,27.8kDa受体,受体表达动态,病毒传播途径
淋巴囊肿病毒病论文文献综述
吴荣华[1]（2015）在《鱼类淋巴囊肿病毒感染对27.8kDa受体表达及牙鲆鳃转录组表达的影响》一文中研究指出淋巴囊肿病是危害水产养殖业健康发展的重要病毒性疾病之一,已知可感染超过42科140种以上的淡水、半咸水和海水鱼类。淋巴囊肿病毒(lymphocystis disease virus, LCDV)为该病的病原,在我国养殖的牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)和花鲈(Lateolabrax japonicus)等经济鱼类中流行较为广泛。研究表明LCDV是通过受体介导作用进入宿主细胞。本实验室前期曾在牙鲆鳃细胞系(FG)上鉴定出一个27.8kDa受体蛋白与LCDV感染有关,并制备了抗27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体。本文在牙鲆FG细胞和胚胎细胞(HINAE)上分析了LCDV感染与27.8kDa受体蛋白表达的相互关系；研究了该受体蛋白在牙鲆、大菱鲆和花鲈中的组织分布及LCDV感染诱导的动态表达特点；探究了27.8kDa受体蛋白在LCDV感染牙鲆外周血白细胞的作用,研究结果促进了对LCDV侵染机制及传播途径的认识；通过RNA-seq分析了LCDV感染后牙鲆鳃转录组表达变化,为揭示LCDV致病机理提供重要数据。具体研究内容和结果如下：(1)牙鲆FG和HINAE细胞上27.8kDa受体蛋白表达与LCDV感染的相互关系研究。蛋白免疫印迹表明,抗27.8kDa受体蛋白单抗可以特异性地结合FG和HINAE细胞膜蛋白中的一条分子量为27.8kDa的蛋白；病毒受体共荧光染色发现,27.8kDa受体表达于FG和HINAE细胞表面,并与LCDV共定位；病毒感染后,细胞中受体蛋白的表达通过双抗夹心ELISA进行检测,结果发现受体蛋白表达水平与病毒滴度呈正相关；感染9天期间,细胞中受体蛋白表达呈先上升后下降趋势；感染期间,细胞中LCDV载量通过荧光定量PCR进行检测,结果发现,病毒的增殖规律与受体蛋白类似,但是其峰值出现时间比受体蛋白要晚。感染过程各个取样时间点,FG细胞中27.8kDa受体蛋白和LCDV载量都比HINAE细胞高。单抗阻断实验显示,当增加抗27.8kDa受体蛋白单抗浓度,感染后细胞中27.8kDa受体蛋白的上调表达和LCDV增殖会受到明显抑制,体外感染实验中相应的细胞病变也明显减少。这些结果表明,预封闭抗27.8kDa受体蛋白单抗可以抑制感染后细胞受体的表达及病毒增殖。本项研究表明,LCDV感染后可以引发细胞中27.8kDa受体出现上调表达,从而又增加了细胞对于LCDV的易感性。(2)27.8kDa受体蛋白在牙鲆、大菱鲆和花鲈的组织分布及LCDV感染后的表达动态。以抗27.8kDa受体蛋白单抗为检测探针,利用间接免疫荧光和免疫组织化学技术对叁种健康鱼的鳃、胃、肠、皮肤、脑、心脏、肝脏、脾脏、头肾、体肾和性腺进行检测,结果表明所检测的组织中都有27.8kDa受体蛋白的阳性信号：利用间接ELISA检测组织中27.8kDa受体蛋白的表达,该受体在健康牙鲆鳃和胃中表达最高,在体肾中表达最低；在大菱鲆中,该受体表达在胃、鳃、心脏和肠中表达相对较高,在卵巢和脑中表达相对较低；在花鲈中,受体表达在鳃和表皮中表达相对较高,在体肾和脑中表达相对较低。病毒感染后,组织中27.8kDa受体蛋白表达呈上调表达。实时荧光定量PCR结果表明,病毒拷贝数随着时间进程而逐渐增多,且较高的LCDV载量一般出现在感染前受体表达量较高的组织。用感染后的血细胞进行间接免疫荧光检测,结果表明,红细胞中没有27.8kDa受体蛋白和LCDV阳性信号,但是某些白细胞亚群中有两者的阳性信号。本研究表明,来源于牙鲆的27.8kDa受体蛋白也在大菱鲆和花鲈感染LCDV中扮演受体蛋白角色,外周血白细胞对病毒的易感性可能导致LCDV在体内的全身感染；LCDV在牙鲆、大菱鲆和花鲈中存在垂直传播的可能。这些数据有助于理解淋巴囊肿致病机理和在鱼类的传播途径。(3)27.8kDa受体蛋白在LCDV感染牙鲆外周血白细胞的意义。本研究通过定位感染病毒后外周血27.8kDa受体蛋白及LCDV的分布来分析LCDV的血液传播。感染3小时后,在牙鲆红细胞中没有检测到27.8kDa受体蛋白和LCDV的阳性信号,但是在部分白细胞中出现了两者的阳性信号。免疫电镜证实,细胞膜表面确实由27.8kDa受体蛋白分布;流式细胞术表明,白细胞中27.8kDa受体蛋白阳性细胞率为14.28%。透射电镜下,对白细胞体外感染LCDV的超薄切片进行观察,结果发现,感染病毒1小时后,病毒吸附于白细胞膜上,而感染36小时后,细胞中LCDV复制则非常充分。多荧光染色实验表明：1)白细胞上27.8kDa受体蛋白和LCDV阳性信号出现共定位于部分白细胞表面；2)CD3阳性细胞与LCDV阳性细胞不交叉；(3)所有的IgM和IgD阳性细胞都对LCDV易感。本研究表明,27.8kDa受体表达于部分白细胞表面,导致这些细胞对LCDV易感,IgM+和IgD+白细胞很可能参与了LCDV的血液传播。(4)牙鲆感染LCDV后鳃组织的转录组学研究。牙鲆感染LCDV一周后,采用RNA测序技术(RNA-seq)分析鳃中的差异表达基因。选取感染和未感染LCDV的鳃组织RNA,通过Illumina HiSeq 2500测序平台进行混合测序。测序后共获得193,225,170个clean reads,拼接组装后得到106,293个unigenes,其中36,537个(34.37%)在公共数据库被成功注释。分析感染前后基因表达水平发现,感染后共有1812个基因出现上调表达,1626个基因发生下调表达,这些差异基因富集于14个Gene Ontology子集和22条信号通路。对这些差异基因进行功能分析发现,它们参与了炎症反应、泛素-蛋白酶体通路、细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤形成及抗病毒感染。实时荧光定量PCR结果表明,RNA-seq结果准确可靠。本项研究数据不仅有助于鉴定与发现牙鲆新基因,并首次对于LCDV感染早期的转录组学应答进行了分析。(本文来源于《中国海洋大学》期刊2015-05-26）
费辰杰[2]（2014）在《鱼类淋巴囊肿病毒32kDa黏附蛋白的特性分析》一文中研究指出淋巴囊肿病毒（lymphocystis disease virus, LCDV）是鱼类淋巴囊肿病的病原，呈世界性分布，可感染42科140种以上的淡水、半咸水和海水鱼类。该病自1997年在我国山东威海地区的养殖牙鲆中首次暴发以来，迅速蔓延至辽宁、河北、浙江等沿海省份，给我国的鱼类养殖业造成巨大经济损失。LCDV是具有囊膜的大分子DNA病毒，囊膜病毒通过囊膜上的单个或多个黏附蛋白与宿主靶细胞上的受体蛋白发生特异性结合而吸附到靶细胞表面，介导病毒与细胞上的蛋白发生构型变化，促进宿主细胞膜与病毒囊膜融合，使病毒的遗传物质进入细胞内部进行复制。研究病毒囊膜上的黏附蛋白对于阐明病毒感染和致病的分子机制具有重要意义。实验室前期曾在牙鲆（Paralichthys olivaceus）鳃细胞（FG）上鉴定出一个分子量为27.8kDa的LCDV细胞受体蛋白，并制备了2株抗27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体（2G11、3D9），2株抗体都能有效阻断LCDV对FG细胞的感染。应用抗27.8kDa受体蛋白单克隆抗体与Far-western技术在LCDV上发现一个分子量为32kDa的蛋白能够与27.8kDa受体蛋白特异性结合，质谱鉴定结果表明该32kDa蛋白是LCDV上038开放阅读框（Open reading frame038，ORF038）编码的蛋白。本论文通过构建LCDV ORF038基因的原核表达载体，重组表达得到ORF038蛋白，制备了其多克隆抗体，并对该32kDa病毒蛋白进行了特性分析，证明该蛋白是LCDV的黏附蛋白，在病毒入侵FG细胞中发挥重要作用，为研究LCDV感染宿主的分子机理，以及寻找阻断病毒感染的有效途径提供了基础资料。具体研究结果如下：根据LCDV ORF038基因序列，设计特异性引物，将ORF038基因和pET-32a表达载体进行定向克隆，构建了LCDV ORF038融合表达载体pET32a-ORF038，转入大肠杆菌Escherichia coli表达菌BL21（DE3），亲和层析柱（GE）纯化重组表达蛋白，获得分子量大小为50kDa的重组表达蛋白；利用该重组蛋白免疫新西兰白兔，制备了兔抗ORF038重组表达蛋白多克隆抗体（多抗）；对LCDV总蛋白和ORF038重组表达蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析，结果显示在分子量约32kDa和50kDa处出现特异性反应条带，而阴性对照无条带出现，表明该抗体具有良好的特异性。利用制备的兔抗ORF038重组蛋白血清与LCDV孵育，胶体金标记羊抗兔IgG作为二抗，免疫电镜技术定位ORF038蛋白编码的32kDa病毒蛋白在LCDV上的分布，结果显示，胶体金颗粒位于LCDV粒子的囊膜上，表明ORF038基因编码的32kDa蛋白是LCDV的囊膜蛋白。利用FITC标记的LCDVORF038重组表达蛋白与FG细胞孵育，免疫荧光实验结果显示，在FG细胞表面出现绿色阳性信号，表明该重组蛋白能够与FG细胞膜上的受体蛋白结合。阻断ELISA实验发现ORF038重组表达蛋白可以阻断单克隆抗体（2G11、3D9）与27.8kDa受体蛋白间的结合，阻断率为63.2%；体外感染中和实验中，将ORF038重组表达蛋白兔多抗进行梯度稀释，并与LCDV预孵育，然后感染FG细胞。结果发现，随着抗体浓度的增加，FG细胞出现CPE的时间相应延迟，且发生病变的细胞数量明显降低，抑制效果与多抗浓度存在剂量依赖效应，表明该兔多抗可以有效中和LCDV，进一步证明LCDV的32kDa蛋白是病毒黏附蛋白，能够与FG细胞上27.8kDa受体蛋白相互作用，在LCDV入侵宿主细胞过程中发挥重要作用。(本文来源于《中国海洋大学》期刊2014-05-30）
闫秀英,孙修勤[3]（2013）在《鱼类淋巴囊肿病毒的分子生物学研究进展》一文中研究指出鱼类淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus,LCDV)遍布全球,且宿主范围广,给水产养殖业造成了严重的损失。国内外学者对LCDV进行了系统的研究。随着对LCDV分子生物学研究的深入,将会建立更加有效防控淋巴囊肿病的途径。对鱼类淋巴囊肿病毒的分子生物学特征、多样性及分子系统学、比较基因组学、功能基因、分子生物学致病机理和病鱼自愈机制及淋巴囊肿病检测、诊断和预防等的分子生物学方法等进行了综述。(本文来源于《安徽农业科学》期刊2013年10期）
宋佳蕾,绳秀珍,战文斌[4]（2012）在《免疫细胞化学法测定鱼类淋巴囊肿病毒(LCDV)滴度》一文中研究指出利用免疫细胞化学法测定鱼类淋巴囊肿病毒(LCDV)滴度。以牙鲆鳃细胞系(FG)作为感染细胞,将生长旺盛的FG细胞接种于48孔培养板中培养至形成细胞单层,用2倍连续稀释的LCDV粗提液分别接种FG细胞。固定各稀释度LCDV感染后的FG细胞,孵育抗牙鲆LCDV单克隆抗体,其后再运用生物素-亲合素反应系统,以碱性磷酸酶底物AP-Red试剂盒发色。倒置显微镜观察,被病毒感染的FG细胞的细胞质呈现红色,未被感染细胞的细胞质呈无色。记录各稀释度病毒感染的阳性细胞孔数,按Reed-Muench法计算组织细胞培养半数感染量(TCID50)。结果显示,免疫细胞化学法测得LCDV在FG的滴度为1.77×210 TCID50/mL。该法可以用来有效测定LCDV滴度,且结果直观、准确性较好,灵敏度较高。(本文来源于《中国海洋大学学报(自然科学版)》期刊2012年05期）
汪沐,绳秀珍,战文斌[5]（2012）在《病毒铺膜印迹技术分离牙鲆鳃细胞上的淋巴囊肿病毒结合蛋白》一文中研究指出利用非变性电泳与病毒铺膜印迹技术(VOPBA)分离了牙鲆(Paralichthys olivaceus)鳃细胞(FG)上淋巴囊肿病毒结合蛋白,结果显示在FG细胞膜上有分子量为135 kD的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合;对该蛋白切胶回收后进行SDS-PAGE与双向电泳,发现135 kD蛋白由3个蛋白组成,分子量分别为58.3 kD、44.6 kD及37.6 kD;135 kD蛋白SDS-PAGE的VOPBA显示,仅出现37.6 kD的蛋白带,而58.3 kD、44.6 kD蛋白皆不与淋巴囊肿病毒结合。结果表明牙鲆FG细胞上135 kD蛋白是淋巴囊肿病毒的结合蛋白,其37.6 kD蛋白具有病毒结合活性。(本文来源于《中国水产科学》期刊2012年03期）
杜程鹏,汪沐,绳秀珍,战文斌[6]（2012）在《淋巴囊肿病毒27.8ku受体蛋白在牙鲆组织中的分布》一文中研究指出应用抗牙鲆淋巴囊肿病毒(lymphocystis disease virus,LCDV)受体蛋白(27.8 ku)的单克隆抗体(2G11和3D9)定位LCDV受体蛋白在牙鲆组织中的分布。通过对牙鲆外周血、白细胞、鳃、胃、肠、表皮、肝脏、头肾、体肾、脾、性腺、脑、心脏等进行LCDV受体蛋白的间接免疫荧光与免疫组织化学定位观察,发现在牙鲆外周血白细胞的细胞膜、鳃上皮细胞、表皮、胃黏膜上皮细胞顶端、肠上皮细胞、肝细胞、脾表层结缔组织细胞及头肾后端的肾小管上皮细胞内均有较强的阳性信号,表明这些部位分布有LCDV的27.8 ku受体蛋白,但在体肾、性腺、脑、心脏及外周血红细胞中未观察到阳性信号。推测LCDV通过与鳃、表皮及消化道上皮的受体结合进入牙鲆体内,通过与外周血白细胞上的受体结合侵染白细胞而进入血液循环,进而感染肝脏、脾脏、头肾等器官。(本文来源于《水产学报》期刊2012年03期）
汪沐[7]（2012）在《牙鲆淋巴囊肿病毒细胞受体的鉴定与特性分析》一文中研究指出鱼类淋巴囊肿病（lymphocystis disease, LCD）是由淋巴囊肿病毒（lymphocystisdisease virus, LCDV）引起的一种典型的皮肤和浅表组织慢性病毒性疾病，已知可感染至少42科140种以上的海水、半咸水和淡水鱼类，尤其在我国养殖的牙鲆中流行较为广泛。有报道表明淋巴囊肿病毒可能通过细胞吞噬和受体介导作用进入宿主细胞。通过封闭细胞受体从而阻断病毒入侵是防治病毒病的一个有效途径。因此，本文旨在通过分离鉴定牙鲆淋巴囊肿病毒受体，促进对淋巴囊肿病毒侵染机制及其在宿主体内传播途径的认识，将对防治淋巴囊肿病有重要意义。本文利用免疫共沉淀技术和病毒铺覆蛋白印迹技术（VOPBA）对牙鲆淋巴囊肿病毒的细胞受体进行分离与鉴定，并用双向电泳、质谱分析及生化方法等对受体蛋白的特性进行分析；制备了病毒受体的单克隆抗体；通过病毒阻断实验确定了淋巴囊肿病毒的细胞受体，并利用所制备的受体单抗研究了病毒受体蛋白在牙鲆各组织中的分布情况。具体结果如下：（1）LCDV及其敏感细胞系牙鲆鳃细胞（Flounder gill cell line，FG）是本文研究LCDV细胞受体的两大关键材料。通过差速离心和蔗糖密度梯度离心得到了LCDV病毒粒子，形态完整，纯度较高；FG细胞用含10%胎牛血清的Eagle's MEM培养基在22℃、2%CO2条件下培养，生长迅速，状态良好。高纯度的LCDV与生长良好的FG细胞为后续研究打下坚实的基础。（2）首先利用NP-40和差速离心抽提出FG细胞膜蛋白，并通过免疫共沉淀法用抗LCDV单克隆抗体和LCDV从FG细胞膜蛋白中沉淀下一个分子量为27.8kDa的LCDV受体蛋白。对该受体蛋白进行质谱分析，结果表明27.8kDa受体蛋白与β-actin蛋白有较强的相关性；利用切胶回收方法提纯该受体蛋白，制备了其多抗，Western blotting显示该多抗主要与FG细胞膜蛋白中的27.8kDa蛋白结合，但也与42.7kDa蛋白微弱结合；用抗β-actin抗体与FG细胞膜蛋白反应，发现其中42.7kDa蛋白有较强反应，而27.8kDa蛋白有较弱反应。因β-actin在不同的物种间高度保守，其分子量大小为42-43kDa左右，故推测27.8kDa蛋白可能是β-actin蛋白的一部分或是一种与β-actin蛋白有某些相似结构域的未知蛋白。（3）利用提纯的27.8kDa受体蛋白免疫Balb/c小鼠，采用单克隆抗体技术经细胞融合、筛选、克隆等，得到了2株单克隆抗体（2G11和3D9）。Westernblotting分析显示这2株单抗均可与FG细胞膜上的27.8kDa蛋白结合，且与其他蛋白无交叉反应。利用2株单抗进行共聚焦免疫荧光和胶体金免疫电镜研究，结果显示FG细胞上与单抗特异性结合的阳性信号主要分布在细胞膜表面，呈点状或线状不连续分布，证实27.8kDa蛋白主要位于细胞膜上。阻断ELISA实验发现单抗2G11和3D9均可部分阻断LCDV与FG细胞膜蛋白的结合，阻断率分别为83.6%和79.4%；病毒体外感染阻断实验结果显示，单抗2G11和3D9可以有效阻断LCDV对FG细胞的感染。（4）采用非变性VOPBA在FG细胞上分离出135kDa受体蛋白，经SDS-PAGE与双向电泳发现135kDa蛋白由58.3kDa、44.6kDa及37.6kDa叁个蛋白组成，其中起病毒结合活性为37.6kDa蛋白。采用免疫共沉淀联合VOPBA的方法分析27.8kDa和37.6kDa蛋白的关系，结果发现在免疫共沉淀中，虽然仅出现27.8kDa蛋白，未出现37.6kDa蛋白，但在用免疫共沉淀结果进行VOPBA时显示出了37.6kDa蛋白，但未出现27.8kDa蛋白，说明FG细胞膜上的27.8kDa蛋白与37.6kDa蛋白均为LCDV的受体蛋白，其中27.8kDa蛋白仅在天然状态下具有病毒结合能力，且在细胞内含量较高；而37.6kDa蛋白的病毒结合能力与其蛋白的二级结构无关，但其在细胞内含量较低。（5）利用免疫共沉淀方法对牙鲆鳃、胃、肠和表皮组织上的LCDV受体蛋白进行分离，发现牙鲆鳃、胃与肠组织蛋白中均有一个分子量为27.8kDa的蛋白能与LCDV特异结合，而表皮中LCDV结合蛋白分子量为37.6kDa。通过能够特异性显示糖蛋白的阿尔新蓝染色法对该免疫共沉淀结果进行染色，发现鳃、胃与肠中的27.8kDa蛋白为非糖蛋白，而表皮中的37.6kDa蛋白为糖蛋白。用Western blotting分析抗27.8kDa蛋白单抗与牙鲆各组织蛋白的结合情况，结果显示该单抗可与牙鲆鳃、胃、肠、肝组织上的27.8kDa蛋白反应，但与表皮、肾和脾组织上的蛋白均无反应。(本文来源于《中国海洋大学》期刊2012-03-01）
杜程鹏[8]（2012）在《淋巴囊肿病毒受体蛋白在牙鲆组织中的分布及其黏附蛋白研究》一文中研究指出鱼类淋巴囊肿病（Lymphocystis disease，LCD）是一种由淋巴囊肿病毒（lymphocystis disease virus, LCDV）引起的鱼类病毒病，其典型症状为引起鱼体皮肤和浅表组织的瘤状病变，有时在鳃、肝、脾等组织也发现有瘤状物。该病呈世界性分布，流行广泛，已知可感染42科140种以上的海水、半咸水和淡水的野生、养殖及观赏鱼类。该病的爆发致使鱼体丧失其观赏和商业价值，严重时可造成死亡，给鱼类养殖业造成巨大的经济损失。了解鱼类组织细胞上与LCDV感染相关的受体蛋白，以及病毒上与细胞受体相互作用的黏附蛋白对阐明LCDV感染的机制以及该病的防控具有重要意义。论文应用本实验室制备的抗牙鲆LCDV27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体（2G11和3D9）确定了LCDV受体在牙鲆组织中的分布，初步探讨LCDV感染牙鲆过程中病毒吸附的生物学基础；并对淋巴囊肿病毒的黏附蛋白进行了初步鉴定，以期为进一步了解病毒与宿主相互作用的机制提供理论依据。另外对LCDV27.8kDa受体在大菱鲆中的存在进行了初步的检测，为研究LCDV对鱼类的广泛性感染提供理论依据。具体研究结果如下：利用LCDV受体单克隆抗体的间接免疫荧光与免疫组织化学技术，对牙鲆外周血、白细胞、鳃、胃、肠、表皮、肝脏、头肾、体肾、脾、性腺、脑、心脏等组织进行了LCDV受体定位观察，发现在牙鲆外周血白细胞、鳃、表皮、胃、肠、肝脏、脾及头肾中均有较强的阳性信号，表明有LCDV27.8kDa受体的分布，这些部位存在介导LCDV吸附、感染牙鲆组织及在组织间扩散的分子基础，推测LCDV通过与鳃、表皮及消化道上皮的受体结合进入牙鲆体内，通过与外周血白细胞上的受体结合侵染白细胞而进入血液循环，实现病毒在体内的传播，进而感染肝脏、脾脏、头肾等器官。利用LCDV受体单克隆抗体对大菱鲆的鳃、肝、体肾、肠、胃等组织进行免疫印迹实验，发现在大菱鲆的鳃、肝、胃、肠中均有蛋白条带特异性显色，证明在大菱鲆中同样分布有LCDV27.8kDa受体的存在，牙鲆与大菱鲆具有相同的细胞受体，且受体在体内组织器官中的分布具有很大的一致性。通过逆向病毒铺覆蛋白印迹技术（VOPBA）对LCDV的黏附蛋白进行鉴定。逆向VOPBA即将LCDV提纯，进行SDS-PAGE，随后将病毒蛋白转移到PVDF膜上，利用病毒的细胞受体蛋白与薄膜共同孵育，通过化学方法显色，显示出能与受体蛋白特异性结合的病毒蛋白条带。实验最终得到一条能与牙鲆LCDV27.8kDa受体蛋白特异性结合的32kDa蛋白条带，对该蛋白进行切胶回收后进行蛋白一级质谱测序，经与基因库进行数据对比，确定该蛋白为LCDV038开放阅读框基因所编码。(本文来源于《中国海洋大学》期刊2012-03-01）
闫秀英,吴灶和,简纪常,鲁义善,孙修勤[9]（2011）在《淋巴囊肿病毒mcp基因变异特征及其基因型分析》一文中研究指出淋巴囊肿病毒是引起多种海、淡水鱼淋巴囊肿病的病原,且不同淋巴囊肿病毒分离株间存在一定的差异。本文对25株淋巴囊肿病毒分离株mcp基因的变异特征进行分析,结果表明:分离自同一宿主的淋巴囊肿病毒mcp基因序列并非完全一致,有些同宿主分离株间存在着较少的变异,其MCP蛋白序列间的变异位点多位于不规则结构域、属于非蛋白相互作用位点;分属不同基因型淋巴囊肿病毒分离株MCP蛋白序列间的变异位点也多位于不规则结构域,变异位点为蛋白相互作用位点的比率仅占21.98%。金头鲷淋巴囊肿病毒分离株LCDV-sa是一种新的淋巴囊肿病毒基因型,此25株淋巴囊肿病毒可分为7个基因型。对淋巴囊肿病毒变异的研究,可加深对其感染机制的认识,有助于了解其传播途径,可为淋巴囊肿病的防控提供重要的理论依据。(本文来源于《中国海洋大学学报(自然科学版)》期刊2011年04期）
徐晓丽[10]（2011）在《对虾白斑症病毒和鱼类淋巴囊肿病毒检测抗体芯片的制备与应用》一文中研究指出病毒性疾病严重威胁着水产养殖业的健康快速发展。鉴于目前病毒病尚无有效的治疗方法,病毒的早期准确检测对疾病的预防和控制尤为重要,因此建立一种多样品、多指标检验并行处理的简便、快速、灵敏、准确的病毒检测方法对病毒病的防控具有重要意义。新兴的抗体芯片技术结合了抗原抗体反应的特异性和芯片高密度集成优势,只需少量生物样品,一次检测便可获得几种甚至几万种有关的生物信息或疾病的检测结果,在人类疾病中病原/疾病标志物等的检测上已显示出广阔的应用前景。但尚未发现有利用抗体芯片法检测水产动物病毒的相关报道。本文将单克隆抗体(单抗)技术、免疫标记技术和抗体芯片技术相结合,以目前水产养殖中的重要病毒病的病原对虾白斑症病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV)和鱼类淋巴囊肿病毒(Lymphocystis Disease Virus, LCDV)为模式病毒,建立了水产动物病毒检测抗体芯片制备体系,优选了芯片载体,优化了反应条件,研究了点样缓冲液、抗体浓度、固定时间、封闭剂种类和浓度、抗原-抗体反应时间、不同标记显色方法等对芯片灵敏度的影响,制备了对虾WSSV检测抗体芯片和鱼类LCDV检测抗体芯片,并将其用于WSSV/LCDV的检测。具体研究结果如下:1.针对芯片载体的选择和处理是制备高质量抗体芯片的关键,本文制备了琼脂糖凝胶、丙烯酰胺凝胶、APES、醛基、巯基、多聚赖氨酸修饰玻片,综合分析了以上6种不同修饰的玻片及氨基化玻片、硝酸纤维素(NC)膜、PVDF膜共9种不同载体对抗体的固定效率和效果。结果显示1.2%琼脂糖凝胶修饰玻片表面信号点圆润、均匀,无边缘扩散和拖尾现象,信号值最高,而其他载体都有不同程度的拖尾现象,表明琼脂糖凝胶修饰玻片对抗体的固定能力和固定效果最好。原子力显微镜显示琼脂糖凝胶修饰玻片表面为均匀的叁维多孔结构,平均表面粗糙度为18.6 nm,结合琼脂糖凝胶表面经NaIO4活化后的醛基基团,能够以物理吸附和共价结合的方式牢固的固定抗体。因此后续实验采取琼脂糖凝胶修饰玻片作为抗体芯片的载体。2.以WSSV/LCDV病毒粒子为模式病毒,采用双抗体夹心方式建立了水产动物病毒的抗体芯片检测体系。提纯WSSV/LCDV病毒粒子,制备病毒的兔抗血清,纯化后进行特性分析。结果显示纯化后得到了高活性、高效价的兔抗WSSV及兔抗LCDV抗体,效价分别为1:64000和1:32000。复苏本研究室前期制备的WSSV/LCDV单抗杂交瘤细胞株,采用腹水生产方法获得大量WSSV/LCDV单抗,辛酸硫酸铵法结合Protein G亲和层析纯化后进行特性分析。结果显示纯化后WSSV/LCDV单抗效价均为1:32000,具很好的活性。采用Cy3抗体标记试剂盒(GE)对纯化后的高效价单抗作Cy3标记,制备了特异性检测WSSV/LCDV的抗体探针,Cy3标记后WSSV/LCDV单抗探针的工作浓度分别为1:2400和1:3000。3.以制备的兔抗WSSV/LCDV多克隆抗体为捕获抗体,用小型手动芯片点样系统将其点样于优选的琼脂糖凝胶修饰的芯片载体上,制备WSSV/LCDV检测抗体芯片。选用特异性强的Cy3标记的WSSV/LCDV单抗为检测抗体。抗体芯片与WSSV/LCDV病毒稀释液孵育形成复合物,该复合物被Cy3标记的特异性WSSV/LCDV单抗探针识别,经CCD芯片扫描仪读取结果。通过改变芯片制备及应用过程中的具体条件参数,对点样缓冲液、点样抗体浓度、固定时间、封闭剂种类和浓度、洗涤方法、抗原-抗体反应时间、不同标记显色方法进行了优化,得到芯片制备与应用的最佳条件。结果显示,点样用捕获抗体采用含50%甘油的PBS调整到合适浓度(兔抗WSSV抗体为0.1 mg/ml,兔抗LCDV抗体为0.5 mg/ml)进行点样,点样后芯片于37℃饱和湿度固定2 h,3%牛血清白蛋白于37℃饱和湿度封闭1 h,依次用dH2O、PBST、PBST洗涤,每次5 min,甩干后低温密封保存。芯片与捕获抗体的反应时间为15~30 min,检测抗体与芯片上的抗原抗体复合物的反应时间15~30 min,不要超过45 min。4.研究了不同载体、不同标记物(包括辣根过氧化物酶(HRP),Cy3,异硫氰酸荧光素(FITC),胶体金和生物素)标记单抗用作检测抗体、芯片保存时间等对检测灵敏度的影响。结果显示,以琼脂糖修饰玻片作为载体制备的抗体芯片,分别采用HRP和Cy3标记抗体探针作为检测抗体,检测灵敏度高,WSSV检测抗体芯片的灵敏度分别为0.15μg/ml和0.31μg/ml,LCDV检测抗体芯片的灵敏度均为0.55μg/ml。WSSV浓度在0.62μg/ml-9.9μg/ml范围内,荧光信号强度与病毒浓度的对数值与呈线性关系,相关系数为0.98925; LCDV浓度在0.55-17.56μg/ml范围内,信号强度与病毒浓度的对数值与呈线性关系,相关系数为0.9900。检测信号经生物素-链酶亲和素系统放大之后,灵敏度明显提高,WSSV检测抗体芯片可达25 ng/ml,LCDV检测抗体芯片可达70 ng/ml。Cy3标记抗体作为检测抗体,抗体芯片于-20℃密封保存4个月后,检测的背景值大幅升高,从而导致相对信号值的下降。HRP标记抗体作为检测抗体,芯片于-20℃下密封保存12个月,WSSV检测抗体芯片的检测灵敏度不变;LCDV检测抗体芯片灵敏度下降至1.1μg/ml。5.利用建立的抗体芯片技术平台,制备了WSSV检测抗体芯片和LCDV检测抗体芯片。将抗体芯片用于对虾WSSV和鱼类LCDV样品的检测,检测结果与酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked Immunosor-bent Assay, ELISA)比较,结果显示WSSV检测抗体芯片与ELISA检测的结果符合率为100%,相关系数为0.9853;LCDV检测抗体芯片与ELISA检测的结果符合率为100%,相关系数为0.9802。说明所制备的抗体芯片能够准确的检测病原,具有很好的特异性与准确性。6.将抗体芯片技术与免疫酶技术结合,采用HRP标记单抗探针作为检测抗体,制备的WSSV/LCDV检测抗体芯片用于对虾WSSV与鱼类LCDV的现场检测,肉眼即可观察检测结果,解决了抗体芯片结果的读取依赖专用仪器的问题。可视化WSSV/LCDV检测抗体芯片用于病毒现场检测,操作简便,无需昂贵仪器,准确性与IIFA法和ELISA法一致,信号值与病毒浓度的对数值呈线性关系,相关系数分别为0.9505和0.9567,可在一定范围内对病毒进行相对定量检测,在苗种选育、养殖生产的疾病监测中有广阔的应用前景。本研究所建立的抗体芯片制备体系能够拓展到其它水产动物病原检测领域,是对传统免疫学检测手段的发展。构建的对虾WSSV检测抗体芯片和鱼类LCDV检测抗体芯片,能够对病毒进行准确检测,具微量化、特异性强、方法敏感、样品处理简单和实验条件易于控制等优点,可用于养殖动物WSSV/LCDV的实验室/养殖现场、进出口检疫中的多样品平行检测,具有广阔的应用前景,并为水产动物病原的多样品多病原平行检测提供了有效的技术参考。(本文来源于《中国海洋大学》期刊2011-03-01）
淋巴囊肿病毒病论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
淋巴囊肿病毒（lymphocystis disease virus, LCDV）是鱼类淋巴囊肿病的病原，呈世界性分布，可感染42科140种以上的淡水、半咸水和海水鱼类。该病自1997年在我国山东威海地区的养殖牙鲆中首次暴发以来，迅速蔓延至辽宁、河北、浙江等沿海省份，给我国的鱼类养殖业造成巨大经济损失。LCDV是具有囊膜的大分子DNA病毒，囊膜病毒通过囊膜上的单个或多个黏附蛋白与宿主靶细胞上的受体蛋白发生特异性结合而吸附到靶细胞表面，介导病毒与细胞上的蛋白发生构型变化，促进宿主细胞膜与病毒囊膜融合，使病毒的遗传物质进入细胞内部进行复制。研究病毒囊膜上的黏附蛋白对于阐明病毒感染和致病的分子机制具有重要意义。实验室前期曾在牙鲆（Paralichthys olivaceus）鳃细胞（FG）上鉴定出一个分子量为27.8kDa的LCDV细胞受体蛋白，并制备了2株抗27.8kDa受体蛋白的单克隆抗体（2G11、3D9），2株抗体都能有效阻断LCDV对FG细胞的感染。应用抗27.8kDa受体蛋白单克隆抗体与Far-western技术在LCDV上发现一个分子量为32kDa的蛋白能够与27.8kDa受体蛋白特异性结合，质谱鉴定结果表明该32kDa蛋白是LCDV上038开放阅读框（Open reading frame038，ORF038）编码的蛋白。本论文通过构建LCDV ORF038基因的原核表达载体，重组表达得到ORF038蛋白，制备了其多克隆抗体，并对该32kDa病毒蛋白进行了特性分析，证明该蛋白是LCDV的黏附蛋白，在病毒入侵FG细胞中发挥重要作用，为研究LCDV感染宿主的分子机理，以及寻找阻断病毒感染的有效途径提供了基础资料。具体研究结果如下：根据LCDV ORF038基因序列，设计特异性引物，将ORF038基因和pET-32a表达载体进行定向克隆，构建了LCDV ORF038融合表达载体pET32a-ORF038，转入大肠杆菌Escherichia coli表达菌BL21（DE3），亲和层析柱（GE）纯化重组表达蛋白，获得分子量大小为50kDa的重组表达蛋白；利用该重组蛋白免疫新西兰白兔，制备了兔抗ORF038重组表达蛋白多克隆抗体（多抗）；对LCDV总蛋白和ORF038重组表达蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析，结果显示在分子量约32kDa和50kDa处出现特异性反应条带，而阴性对照无条带出现，表明该抗体具有良好的特异性。利用制备的兔抗ORF038重组蛋白血清与LCDV孵育，胶体金标记羊抗兔IgG作为二抗，免疫电镜技术定位ORF038蛋白编码的32kDa病毒蛋白在LCDV上的分布，结果显示，胶体金颗粒位于LCDV粒子的囊膜上，表明ORF038基因编码的32kDa蛋白是LCDV的囊膜蛋白。利用FITC标记的LCDVORF038重组表达蛋白与FG细胞孵育，免疫荧光实验结果显示，在FG细胞表面出现绿色阳性信号，表明该重组蛋白能够与FG细胞膜上的受体蛋白结合。阻断ELISA实验发现ORF038重组表达蛋白可以阻断单克隆抗体（2G11、3D9）与27.8kDa受体蛋白间的结合，阻断率为63.2%；体外感染中和实验中，将ORF038重组表达蛋白兔多抗进行梯度稀释，并与LCDV预孵育，然后感染FG细胞。结果发现，随着抗体浓度的增加，FG细胞出现CPE的时间相应延迟，且发生病变的细胞数量明显降低，抑制效果与多抗浓度存在剂量依赖效应，表明该兔多抗可以有效中和LCDV，进一步证明LCDV的32kDa蛋白是病毒黏附蛋白，能够与FG细胞上27.8kDa受体蛋白相互作用，在LCDV入侵宿主细胞过程中发挥重要作用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
淋巴囊肿病毒病论文参考文献
[1].吴荣华.鱼类淋巴囊肿病毒感染对27.8kDa受体表达及牙鲆鳃转录组表达的影响[D].中国海洋大学.2015
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[7].汪沐.牙鲆淋巴囊肿病毒细胞受体的鉴定与特性分析[D].中国海洋大学.2012
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[9].闫秀英,吴灶和,简纪常,鲁义善,孙修勤.淋巴囊肿病毒mcp基因变异特征及其基因型分析[J].中国海洋大学学报(自然科学版).2011
[10].徐晓丽.对虾白斑症病毒和鱼类淋巴囊肿病毒检测抗体芯片的制备与应用[D].中国海洋大学.2011