真枝藻目环化酶FamC1和FilC1的结构与功能研究

论文摘要

Hapalindole吲哚生物碱是真枝藻目蓝绿藻的一类次级代谢产物,它拥有多个复杂的手性中心,具有广泛的抗菌、抗肿瘤和杀虫等生物活性。近年来,多环系统和潜在的应用价值让其倍受关注,逐渐成为生物化学合成领域的研究热点。本论文研究的FamC1和FilC1这两个真枝藻目环化酶,它们在Hapalindole吲哚生物碱生物合成中发挥了重要的催化作用。因此,其结构与功能催化方面的研究在Hapalindole生物碱生物合成中是尤为重要的。本论文首先将无跨膜区的FamC1和FilC1在E.coli BL21（DE3）表达后经过Ni-NTA和DEAE两步层析纯化蛋白。晶体初筛主要采用坐滴法在48孔晶体板中对Hampton Research晶体筛选试剂盒进行条件筛选。通过汞衍生物的制备和晶体衍射数据的收集,利用SIRAS方法获得了 FamC1初始电子密度图。通过Phenix和Coot进行结构的修正成功解析出FamC1晶体结构。FilC1的结构利用FamC1结构作为模板通过MR方法获得。此外,为了找到底物结合的关键位点,通过浸泡底物类似物法成功获得了 FilC1与CI4、FilC1与4IB复合体结构。FamC1和FilC1晶体结构是一种β三明治构造,由反向平行的β折叠链形成的两个的β片层构成。底物结合口袋位于柔性较大的loop区而且在结构中还看到两个钙离子结合在活性口袋附近。另外,通过复合体结构的分析,找到了活性中心关键位点,并提出FamC1和FilC1催化生成12-epi-hapalindole U生物碱的可能机制。本论文利用晶体X射线衍射技术解析了FamC1和FilC1这两个真枝藻目环化酶Native及复合体的结构,通过结构分析和相关酶活检测,阐述了生物催化的可能机制。这些研究结果为其他真枝藻目环化酶的研究提供了重要的理论指导,在Hapalindole生物碱生物合成中也具有重要的意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 研究背景
•   1.1 吲哚生物碱
•     1.1.1 吲哚生物碱分类
•     1.1.2 吲哚生物碱的应用
•   1.2 真枝藻目吲哚类生物碱
•     1.2.1 真枝藻目分类及性质
•     1.2.2 真枝藻目吲哚生物碱的功能
•   1.3 真枝藻目环化酶的发现和分类
•   1.4 Stig cyclases与Hapalindole类生物碱
•   1.5 Stig cyclases研究现状
•   1.6 本论文研究意义和方法
•     1.6.1 研究目的与意义
•     1.6.2 研究方法
• 第2章 实验材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 载体和宿主菌株
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 实验仪器
•     2.1.4 培养基配制
•     2.1.5 溶液配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 信息调研和生物信息预测
•     2.2.2 目的基因的合成
•     2.2.3 FamC1和FilC1分子克隆
•     2.2.4 FamC1定点突变体构建
•     2.2.5 表达菌株的构建
•     2.2.6 蛋白表达
•     2.2.7 蛋白纯化的方法
•     2.2.8 蛋白晶体的初筛和优化
•     2.2.9 X射线衍射数据收集
•     2.2.10 重金属浸泡及相位确定
•     2.2.11 结构模型修正
•     2.2.12 复合体结构确定
•     2.2.13 酶活性检测
• 第3章 结果与讨论
•   3.1 FamC1和FilC1表达纯化与结晶
•     3.1.1 生物信息学预测
•     3.1.2 FamC1和FilC1分子克隆
•     3.1.3 FamC1和FilC1表达纯化
•     3.1.4 FamC1和FilC1晶体初筛与优化
•     3.1.5 FamC1 I118C数据收集及相位解析
•     3.1.6 FamC1、FilC1晶体及复合体数据的收集处理
•   3.2 FamC1和FilC1结构分析
•   3.3 复合体的结构分析
•   3.4 FamC1突变体构建
•     3.4.1 FamC1突变体表达纯化
•     3.4.2 FamC1突变体酶活性检测
•   3.5 钙离子结合位点分析
•     3.5.1 FamC1 N137A晶体培养与优化
•     3.5.2 FamC1 N137A晶体数据收集和处理
•     3.5.3 FamC1 N137A晶体结构解析
•   3.6 FamC1和FilC1潜在的催化机制
• 第4章 结论
• 第5章 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 唐雪珂

导师: 郭瑞庭

关键词: 真枝藻目环化酶,晶体射线衍射,晶体结构

来源: 中国科学技术大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国科学技术大学

分类号: Q946.5

总页数: 80

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