原生动物八肋游仆虫NMD途径UPF因子的功能分析

论文摘要

基因的准确表达对于机体细胞正常的生理活动至关重要,它受到了细胞中多种不同分子机制的调控。其中,无义介导的mRNA降解途径（nonsense-mediated mRNA decay,NMD）,它作为一种真核生物基因表达质量控制机制,能够识别并降解那些含有提前终止密码子（premature termination codons,PTCs）的无义mRNA。mRNA降解依赖于细胞内蛋白质翻译过程,目前已知可以调节植物、动物、真菌和纤毛虫中转录物的表达水平。无义mRNA的识别是NMD机制的核心,UPF（up-frameshift）蛋白质是识别和降解无义mRNA的一类关键因子。前期研究表明,在八肋游仆虫（Euplotes octocarinatus）细胞中仅有UPF1和UPF2两种UPF蛋白质,没有发现存在于人和酵母等细胞中的UPF3。生物信息学分析显示,八肋游仆虫的UPF2（EoUPF2）包含三个串联的MIF4G（middle domain of translation initiation factor 4G）结构域和一个C末端UPF1的结合区域。大多数真核生物共享核心NMD因子,而NMD途径的分子机制在生物体之间却有所不同。本文中,首先对EoUPF1和其他真核生物UPF1共26个物种,以及EoUPF2和其他真核生物UPF2共24个物种的氨基酸序列进行比对,分别构建系统进化树,从它们的进化关系分析发现,EoUPF1与EoUPF2均与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的进化关系较为接近。利用InterPro数据库分析,结果显示二者的核心结构域非常相似。其次,通过pull down实验验证了EoUPF1和EoUPF2之间、以及各自与第二类肽链释放因子eRF3（eukaryotic polypeptide release factor 3）之间,存在的相互作用关系,我们推测在八肋游仆虫细胞中,EoUPF1、EoUPF2与eRF3形成eRF3/EoUPF1/EoUPF2复合体。最后,我们进一步通过酵母双杂交和pull down实验证实,EoUPF2的MIF4G结构域与外显子连接复合体（exon-exon junction complex,EJC）组成因子Y14a/Y14b可以相互作用。在高等真核细胞中,UPF3介导UPF2与EJC核心因子Y14的相互作用,而八肋游仆虫细胞中没有UPF3因子。那么,EoUPF2在没有UPF3存在的情况下如何发挥功能呢?本研究证实,EoUPF2通过其MIF4G结构直接与EJC组成因子Y14a和Y14b相互作用。在β-半乳糖苷酶实验中,我们发现EoUPF2与Y14a的作用更强一些;而实时荧光定量PCR分析结果排除了EoUPF2与Y14a和Y14b相互作用强弱与Y14a和Y14b本身的拷贝数有关。由此,我们针对八肋游仆虫细胞的NMD途径启动机制提出假设:核糖体翻译过程中遇到提前终止密码子（PTC）时会停下来,eRF3与EoUPF1、EoUPF2相互作用,然后形成了eRF3/EoUPF1/EoUPF2复合体。而EoUPF2通过与EoUPF1和Y14相互作用,介导了eRF3/EoUPF1/EoUPF2复合体与EJC的耦联,启动了无义mRNA的识别过程。本文的实验结果,可以为进一步阐明八肋游仆虫NMD机制提供支持。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 mRNA质量监控机制
•   1.2 NMD途径的底物
•   1.3 NMD途径的相关因子
•     1.3.1 蛋白质翻译肽链释放因子
•     1.3.2 SURF复合体
•     1.3.3 EJC复合体
•     1.3.4 DECID复合体
•     1.3.5 其他SMG酶
•     1.3.6 相关降解酶
•   1.4 NMD途径的模型
•   1.5 关于八肋游仆虫NMD通路的研究现状
•   1.6 本课题的研究意义
• 第二章 八肋游仆虫UPF因子的结构及进化关系
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•   2.3 实验方法
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 EoUPF1的进化关系
•     2.4.2 EoUPF2的进化关系
•     2.4.3 八肋游仆虫UPF因子的结构特征
•   2.5 讨论
• 第三章 八肋游仆虫肽链释放因子与UPF1和UPF2形成复合体
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 菌株和质粒
•     3.2.2 主要试剂
•     3.2.3 试剂的配制
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 序列分析与引物设计
•     3.3.2 八肋游仆虫c DNA的获得
•     3.3.3 重组质粒的构建
•     3.3.4 目的蛋白的体外表达
•     3.3.5 体外Pull down实验
•     3.3.6 Western blot分析
•   3.4 实验结果
•     3.4.1 UPF1、UPF2和eRF3相关重组质粒的构建
•     3.4.2 EoUPF1-CH与EoUPF2-C的体外原核表达
•     3.4.3 eRF3与EoUPF1、EoUPF2的Pull down结果分析
•   3.5 讨论
• 第四章 八肋游仆虫UPF2介导NMD途径中eRF/UPF1/UPF2复合体和EJC的耦联
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 菌株和质粒
•     4.2.2 主要试剂
•     4.2.3 试剂的配制
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 序列检索和分析
•     4.3.2 重组质粒的构建
•     4.3.3 酵母双杂交
•     4.3.4 测定β-半乳糖苷酶活性
•     4.3.5 蛋白的表达及体外Pull down分析
•     4.3.6 定量PCR分析Y14a和Y14b拷贝数
•   4.4 实验结果
•     4.4.1 相关重组质粒的构建
•     4.4.2 UPF2的关键功能域与Y14a/Y14b的关系
•     4.4.3 分析EJC组成因子Y14a和Y14b的表达水平
•   4.5 讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 攻读硕士期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简介及联系方式

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 柴杨丽

导师: 柴宝峰,梁爱华

关键词: 无义介导的降解,提前终止密码子,上游移码蛋白,外显子连接复合体,肽链释放因子

来源: 山西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山西大学

分类号: Q78

DOI: 10.27284/d.cnki.gsxiu.2019.000151

总页数: 68

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