张新娜徐进乔丹
[摘要]苹果通过组织培养快速繁殖的技术简介，针对外植体不同介绍部分种类的苹果组织培养技术。分析组培技术中重点问题的解决途径及其研究进度。
[关键词]苹果组织培养脱毒褐化研究进度
一、苹果组织培养技术
1.器官培养（花药培养）
①培养程序花粉植株的诱导需要经过三个步骤：第一步是胚状体的诱导，花药接种后最早经过70天左右即由变褐的花药裂口处开始产生胚状体，一般是在接种后的90-120天开始产生胚状体；第二步是五根苗的诱导，即将胚状体转移到芽分化的培养基上可形成此生胚状体或丛生芽，进而发育成无根的支柱，这一过程，需经过40-100天左右或更长时间；第三步是根系的诱导，即将无根小植株转移到诱导跟的培养基上，以形成完整植株，需要15-20天左右。
②材料灭菌与培养条件为了得到不同品种的较多的胚状体，必须有足够的材料，而且要适时接种，但有时春季气温突然上升，往往在1-2天或2-3天就会错过接种最适时期。因此，除了集中力量接种外，还需要建立材料妥善保存的方法，以延迟接种时间。一般做法是将剪下来的花蕾枝插入盛水的玻璃缸内，保存在1-3摄氏度的冰箱中，这样可以控制和延迟花粉的发育时间。试验表明，花蕾低温贮存40天接种，仍能形成胚状体。
材料的灭菌方法是：先摘取花蕾，去掉幼叶，注意将粘连的花蕾分开；先将材料进入70%酒精中约半分钟，取出花蕾，再浸入10%漂白粉上清液中约15-20分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，即可将材料置于灭菌的培养皿中。
培养室的温度应保持在25-30摄氏度，光照1500-2000Lux，每天关照10小时。在胚状体诱导阶段，光和暗培养均能诱导出胚状体。
③无根芽丛的繁殖由于每个胚状体最多只能发育成一株完整植株，这些植株再经几次转移、染色体鉴定和移栽等，会有很多的植株中途夭折。为了避免材料损失，胚状体转入芽丛分化的培养基中即MS培养基附加GA0.1mg/l、IBA0.5mg/l，BA1mg/l，使胚状体在这种培养基上迅速增值，形成很多次生胚状体或直接分化出芽。随着胚状体或芽的增殖，有些材料逐渐转绿，并很快分化出无根植株。有的胚状体转绿后先分化出芽状物，再由切离下来的胚状物抽出无根小植株。有的转绿后直接分化出叶丛状组织，再分化出多个无根小植株。
2.矮化砧组织培养
①培养材料（无菌材料的获得）一般来说，用于苹果砧木组织培养的材料，最好的是苹果带腋芽的茎段。3月底、4月初在田间选用腋芽饱满的枝条，剪成1.5cm大小的茎段(每个茎段的一端带有1个腋芽)，剥去茎段外表皮及少许芽鳞片后，流水冲洗30min，70%酒精消毒35s，倒出多余酒精，直接加入0.1%HgCl2振荡灭菌10min，无菌水冲洗4-5遍，再使用2.5mg•mL-1的头孢曲松钠溶液(注射用头孢曲松钠，上海新先锋药业有限公司)浸泡1.0-1.5h效果更好。
②培养基的选择较为常用的培养基有：(1)MS；(2)MS+6-BA1.0mg•L-1+NAA0.1；(3)MS+6-BA1.0+NAA0.2；(4)MS+6-BA0.9+IBA0.3；(5)MS+6-BA0.8+IBA0.4；(6)1/2MS+NAA0.6+IBA0.2；(7)1/2MS+NAA0.3+IBA0.6。
③不定芽的分化及丛生芽增殖将经头孢曲松钠溶液浸泡后的无菌腋芽从茎段上取下，直接接种至培养基(1)上。1周左右选择萌发良好的腋芽分别转接在培养基(2)、(3)上，4周后不定芽分化。在培养基(2)上不定芽分化效果较好。将丛生芽切成含2-3个芽的小块，分别接种到培养基(4)、(5)上，丛生芽得到大量增殖。每20d继代1次，其中培养基(4)的新芽分化更好，增殖系数为7-8。
④诱导生根及移栽取株高1.5-2.0cm的小苗，接种到生根培养基(6)、(7)上培养3周左右，生根率达90%。炼苗1d后，取出，洗干净，去掉根上的琼脂，栽于经高锰酸钾消毒后的砂床上，上覆地膜，保持80%湿度。移栽2周后开始长出新的根、叶。
二、主要问题的研究进度
1.脱毒
1.1脱毒技术（以茎尖脱毒为例）
热处理是应用最早的脱毒技术。单纯热处理，其脱毒率较低，据报道为20-30%。最好是针对试管苗进行热处理后再结合茎尖培养，脱毒效果好。植物感染病毒后，病毒在其体内全面扩散，但并非均匀分布。病毒病毒浓度常因器官部位不同而有很大差异。通过有性生殖过程形成的种子以及旺盛生长的根尖、茎尖一般都无或很少用病毒。
1.2病毒检测技术
经过脱毒处理后的苗木须经过病毒检测，证明其无毒后才能应用。目前国内常用的病毒检测方法有木本指示植物鉴定法和酶联免疫吸附法（ELISA）。由于所有果树病毒都可通过嫁接传染，所以可以通过嫁接，是病毒从待检植物传到指示植物。木本指示植物见低昂发可在大田或温室进行，也可采用试管嫁接方法在超净工作台上进行。
2.褐变的处理方法
2.1母株和外植体的预处理
为降低切割对细胞造成的伤害,用于切割的解剖刀必须尽可能的锋利,解剖刀的消毒不能过分灼烧,否则会使刀刃变钝。苹果的外植体在5℃下进行低温预处理一段时间均有助于减轻褐化。预培养有助于减轻酚类物质和其他生长抑制物的毒害作用。在20年生的苹果本植株上采集的茎芽,需先在液体培养基上培养3d,然后再在半固体培养基上培养。
2.2选择适宜的培养基及培养条件
在最适宜的条件下,外植体处于旺盛的生长状态,有较强的分生能力,便可大大减轻褐变。研究表明,不同基本培养基抑制褐变的效果是不同的。苹果用1/2MS培养基可减轻褐化,在初始培养中把外植体处于不适合酚类合成的条件下,如在黑暗中或弱光下培养,可抑制酚类的氧化。
参考文献
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