水稻粒型调控基因OsUBP15的图位克隆与功能分析

论文摘要

水稻（Oryza sativa L.）是世界上重要的粮食作物。水稻粒型的研究对培育高产优质的水稻品种具有重要的意义。水稻的粒型包括粒宽、粒长和粒厚,它们在很大程度上影响水稻籽粒的粒重,最终影响水稻的产量。同时,粒型也是一个重要的品质性状,它影响到稻米的外观品质、加工品质和食用品质。尽管目前已经克隆出部分控制水稻粒型的基因,但是由于粒型是一个复杂性状,其遗传调控网络仍然有待阐明,需要发掘和克隆更多的粒型调控基因,并研究它们的互作关系。本研究中,通过对来自于粳稻品种Kitaake组织培养的宽粒突变体lg1-D（large grain1-D）的图位克隆,发现了编码一个泛素特异性蛋白酶OsUBP15的编码基因参与了粒型的形成,并对OsUBP15基因进行了功能分析。具体结果如下:1.与野生型相比,突变体lg1-D籽粒的粒宽、粒长和粒厚分别增加了30.8%、13.23%、13.8%,千粒重增加了30%以上。株高有所降低、穗长缩短,株型和穗型变得直立,分蘖数和穗粒数有所减少,单株产量没有显著的变化。通过籽粒灌浆过程中干物质积累的测定发现突变体lg1-D的灌浆速率从花后第九天开始显著高于野生型,从花后12天开始干物质积累量显著高于野生型。2.通过开花前颖壳横向石蜡切片的观察和统计发现,突变体lg1-D颖壳在横向上细胞数目极显著增加,说明突变体lg1-D粒宽的增加主要是由细胞数目的增加引起的;扫描电镜观察发现突变体lg1-D颖壳纵向表面的细胞缩短,推测突变体lg1-D粒长的增加也是由于颖壳纵向细胞数目增加引起。3.遗传分析表明突变体lg1-D由半显性单基因控制。将突变体lg1-D与籼稻品种协青早B杂交,利用F2定位群体将突变基因定位在第2号染色体短臂物理距离89 kb的区间内。该区间内有6个ORFs,基因组测序发现,只有ORF2（LOC02g14730）最后一个外显子上存在一个单碱基的替换,导致蛋白翻译提前终止,产生的突变体蛋白在C端缺失了160个氨基酸残基。ORF2编码一个泛素特异性蛋白酶（OsUBP15）。转基因互补和干扰验证,OsUBP15的突变就是导致突变体表型的原因,并证明OsUBP15正向调控水稻粒宽,突变体lg1-D为功能获得型突变。4.荧光定量RT-PCR实验和转基因植株GUS组织染色实验证明,OsUBP15呈现组成型表达模式,在根、茎、叶、叶鞘、幼穗、发育中的籽粒中均有表达,在幼穗中表达量相对较高。通过对gOsUBP15-GFP转基因株系幼根GFP的观察发现,OsUBP15在细胞核和细胞质中均有分布。5.体外去泛素实验证明,OsUBP15蛋白具有去泛素功能,可以从泛素前体上将单个的泛素分子切割下来。同时由lg1-D编码的突变蛋白Osubp15也具有去泛素的功能。说明突变蛋白C-端缺失并没有失去泛素酶的功能。烟草瞬时表达发现Osubp15-GFP融合蛋白在细胞中积累量明显高于OsUBP15-GFP,推测Osubp15蛋白稳定性提高,然后通过LUC实验证明了Osubp15蛋白的稳定性高于野生型OsUBP15蛋白。突变体lg1-D表型变化是由于Osubp15蛋白稳定性提高,细胞内Osubp15蛋白积累量增加引起的。6.酵母双杂交实验和Pull-down实验证明OsUBP15能够和水稻中与拟南芥AtDA1同源的蛋白OsDA1互作,并且OsDA1可以调控OsUBP15蛋白的降解,这与拟南芥中的报道一致。突变体蛋白Osubp15也具有和OsDA1互作的能力,但在酵母双杂交实验中发现,Osubp15和OsDA1互作的能力比野生型OsUBP15蛋白弱。7.利用CRISPR/CAS9技术,在野生型的背景下敲除OsUBP15使粒宽变窄,敲除GW2使粒宽变宽,而双突变体lg1-2 gw2-4和lg1-3 gw2-3粒宽并不是典型的加性效应;在lg1-D背景下将GW2敲除,粒宽增加的幅度低于野生型背景下GW2敲出的株系,说明OsUBP15和GW2在遗传关系上并不是完全独立的。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 水稻种子的结构
•   1.2 水稻粒型的遗传分析
•   1.3 水稻粒型调控的分子机制
•     1.3.1 转录调控途径
•     1.3.2 内源激素调控途径
•     1.3.3 G蛋白信号传导途径
•     1.3.4 泛素-蛋白酶体途径
•     1.3.5 其它调控途径
•   1.4 泛素系统
•     1.4.1 泛素蛋白
•     1.4.2 泛素激活酶E
•     1.4.3 泛素结合酶E
•     1.4.4 泛素连接酶E
•     1.4.5 26S蛋白酶体
•     1.4.6 去泛素酶（DUB）
•   1.5 本研究的目的与意义
• 第二章 水稻宽粒突变体lg1-D的表型分析
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 材料种植
•     2.1.2 农艺性状调查
•     2.1.3 灌浆速率的测量
•     2.1.4 颖壳石蜡切片观察
•     2.1.5 颖壳表面及籽粒横切面扫描电镜观察
•   2.2 结果分析
•     2.2.1 宽粒突变体lg1-D的表型分析
•     2.2.2 灌浆速率的调查
•     2.2.3 颖壳细胞学观察
•   2.3 小结
• 第三章 水稻粒型基因OsUBP15 的图位克隆
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 材料种植
•     3.1.2 水稻基因组总DNA的提取
•     3.1.3 InDel标记的开发
•     3.1.4 PCR扩增
•     3.1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳
•     3.1.6 候选基因的预测
•     3.1.7 互补载体的构建
•     3.1.8 干扰载体的构建
•     3.1.9 大肠杆菌感受态细胞的转化
•     3.1.10 农杆菌感受态的制备和转化
•     3.1.11 转基因植株的鉴定
•   3.2 结果分析
•     3.2.1 lg1-D突变体的遗传分析
•     3.2.2 突变基因精细定位与候选基因的确定
•     3.2.3 转基因验证
•   3.3 小结
• 第四章 OsUBP15 的功能验证
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 RNA的提取
•     4.1.2 cDNA的合成
•     4.1.3 Real-time PCR
•     4.1.4 GUS染色
•     4.1.5 氨基酸序列比对和进化树构建
•     4.1.6 原生质体的制备和转化
•     4.1.7 体外去泛素化酶活性检测
•     4.1.8 荧光素酶活性检测
•     4.1.9 体外Pull-down
•     4.1.10 Western blot检测
•     4.1.11 酵母双杂交
•     4.1.12 利用CRISPR构建定点突变体
•   4.2 结果分析
•     4.2.1 ORF2 蛋白序列分析
•     4.2.2 OsUBP15基因的时空表达
•     4.2.3 OsUBP15蛋白亚细胞定位
•     4.2.4 OsUBP15去泛素酶活性检测
•     4.2.5 OsUBP15蛋白稳定性检测
•     4.2.6 OsDA1与OsUBP15互作并调控其稳定性
•     4.2.7 OsUBP15与GW2的遗传关系
•   4.3 小结
• 第五章 全文讨论
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 师翠兰

导师: 翟虎渠

关键词: 水稻,粒型,基因克隆,去泛素酶

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 中国农业科学院

分类号: S511;Q943.2

总页数: 90

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