果蝇Trf4-1介导mRNA/miRNA的转录调控及机制研究

论文摘要

从酵母、植物、果蝇到哺乳动物,报道的Trf均为多聚腺苷化聚合酶或末端转移酶（PAP/TNTase）,可以对细胞内的RNA进行末端修饰,一般是尿苷化或腺苷化修饰。一般的PAP/TNTase可以调节mRNA,pre-mi RNA和mi RNA以及细胞核内sn RNA。多聚寡聚核苷酸化（poly-Oligonucleotion）的修饰往往会导致被修饰RNA的降解,通常会募集相关的3’-5’外切核酸酶,如SDN1、Dis3l2和RRP6。相关RNA的单核苷酸化则被报道可以修饰缺失1nt的特殊结构RNA,如pre-mi RNA和mi RNA,它们3’端一般只有满足2nt的突出（3’2nt overhang）才会行使其正常功能。Trf首先是在酵母里鉴定的,除了报道的PAP/TNTase功能外,较早的研究中还发掘了其他功能。首先,Trf4可以在酵母减数分裂中介导染色质浓缩、纺锤体延伸和细胞核分离缺陷。其次,Trf4和Trf5与染色体相关联,其在体外表现有DNA聚合酶（DNA聚合酶σ）活性。再者,酵母中的Trf4缺陷型变现出由R loop介导转录依赖的超重组表型（hyperrecombination phenotype）,但是转录似乎没有受到影响。果蝇Trf4-1是根据酵母Trf4同源比对鉴定的,其在体外的反应中可以介导poly（A）反应,而其同源蛋白Trf4-2则没有。Trf4-1首先被确定定位在细胞核内,多聚腺苷酸化核内小RNA（sn RNA）并通过与RRP6直接作用降解之。另一课题组推断Trf4-1是位于细胞质内的,可以促进胞质内mRNA的降解。这两项结果归结在一起表明Trf4-1可能既位于细胞核中也位于细胞质中。Trf4-1在细胞质中不同位置的功能均与其PAP/TNT功能相关。在我们的研究中,敲低Trf4-1后相关基因mRNA水平是下调的。Trf4-1对mRNA的正调控结果表明其可能采取不同的机制保护mRNA。通过GRO（global running on）实验表明,Trf4-1可以正调控新生成RNA链（nascent RNA）。SAIA突变体依然可以行使同样的功能,表明PAP/TNT活性结构域对mRNA的正调控无影响。过表达SAIA突变体也可以上调mRNA水平。综上结果表明Trf4-1对mRNA的正调控是不依赖于其PAP/TNT活性的,正调控的Trf4-1可能作用于mRNA的转录。Pri-mi RNA的初级产物与mRNA具有相似的结构并且也是由pol Ⅱ转录得到。实验发现,Trf4-1可以在Drosha切割的上游作用于pri-mi RNA并且正调控pri-mi RNA的表达水平。Trf4-1敲低后primi RNA下调进而降低了成熟的mi RNA的合成,导致成熟的mi RNA表达下调。转录组测序和小RNA测序结果表明,Trf4-1可以较为广谱地调节mRNA和pri-mi RNA转录。Trf4-1可以间接作用于转录核心蛋白pol Ⅱ,影响其在染色质各个区域的前进,导致pol Ⅱ在各区域的异常积累。pol Ⅱ的异常积累会引发pol Ⅱ在各个区域被劫持从而影响pol Ⅱ的流转（turn over）。此外,Trf4-1的敲低还降低了启动子区域H3K4me3的水平。但是免疫印迹结果却表明Trf4-1不会直接影响相关蛋白的稳定性。HA-Trf4-1-Ch IP结果也没有检测到其与染色质的直接相互作用。免疫共沉淀质谱结果分析,发现Trf4-1可以与转录相关蛋白、核定位蛋白以及核糖体蛋白相关联,尤其是组蛋白H2A.V。哺乳动物细胞中同源蛋白PAPD5也可以介导mRNA的转录并且其免疫沉淀质谱结果也得到了同Trf4-1类似的结果。综上结果表明,Trf4-1确实可以调节mRNA和pri-mi RNA的转录,且主要通过影响pol Ⅱ蛋白和相关组蛋白的功能。

论文目录

• 论文创新点
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
•   1.1 RNA聚合酶Ⅱ介导的转录概述
•     1.1.1 RNA聚合酶简介
•     1.1.2 转录起始及复合物组装
•     1.1.3 启动子附近pol Ⅱ暂停（Promoter-proximal pausing）概述
•   1.2 miRNA的生成过程及机制
•     1.2.1 核内pre-miRNA的加工生成
•     1.2.2 质内成熟miRNA的加工
•     1.2.3 组蛋白及其修饰对转录的调控
•     1.2.4 经典组蛋白
•     1.2.5 组蛋白变异体
•     1.2.6 组蛋白翻译后修饰
•     1.2.7 组蛋白变化对转录的调控
•   1.3 拓扑异构酶（topoisomerases）及其在转录中的作用
•     1.3.1 拓扑异构酶与染色质相互作用
•     1.3.2 拓扑异构酶与转录
•   1.4 R loop（s）的形成及作用机制
•     1.4.1 机体内调控R loops的相关活性
•     1.4.2 R loops对pol Ⅱ驱动的转录的调控
•   1.5 TRF的研究进展
• 2 果蝇Trf4-1 调控mRNA的转录
•   2.1 概述
•   2.2 材料和方法
•     2.2.1 实验材料
•     2.2.2 实验方法
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 细胞水平中Trf4-1 的敲低下调mRNA表达水平
•     2.3.2 果蝇成虫中Trf4-1 的敲低下调mRNA表达水平
•     2.3.3 Trf4-1 对mRNA的影响是转录水平的且始于起始阶段
•     2.3.4 Trf4-1 对mRNA的影响是启动子非依赖的
•     2.3.5 Trf4-1 对转录的作用是PAP/TUTase活性非依赖的
•     2.3.6 Trf4-1 的过表达可以上调mRNA表达水平
•     2.3.7 Trf4-1 的敲低对转录组的影响
•   2.4 实验讨论
• 3 果蝇Trf4-1 调控miRNA的转录
•   3.1 概述
•   3.2 材料和方法
•     3.2.1 实验材料
•     3.2.2 实验方法
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 果蝇pri-miRNA的表达水平受到Trf4-1 的正调控
•     3.3.2 Trf4-1 在Drosha上游的转录水平起作用
•     3.3.3 Trf4-1 对成熟的miRNA的生成的影响
•     3.3.4 Trf4-1 对miRNA的广泛性影响
•   3.4 实验讨论
• 4 Trf4-1 通过作用于pol Ⅱ及组蛋白介导其对转录的影响
•   4.1 概述
•   4.2 材料和方法
•     4.2.1 实验材料
•     4.2.2 实验方法
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 Trf4-1 敲低不影响pol Ⅱ和组蛋白H3稳定性
•     4.3.2 Trf4-1 敲低导致pol Ⅱ在转录各阶段积累和延搁（delay）
•     4.3.3 Trf4-1 影响H3K4me3在启动子区域的结合能力
•   4.4 实验讨论
• 附录一 论文中使用的不同引物和序列
•   附表1 质粒构建、ds RNA及small RNA探针扩增引物和合成RNA的序列
•   附表2 mRNA、pri-miRNA及GRO实验中qPCR引物
• 附录二 果蝇Trf41ΔN270质谱差异表达结果（部分结果）
• 参考文献
• 攻博期间发表或待发表的科研成果目录
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘永祥

导师: 周溪

关键词: 果蝇,转录,聚合酶,组蛋白

来源: 武汉大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 武汉大学

分类号: Q75

总页数: 105

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