论文摘要
基因的定点修饰技术是研究基因功能的重要手段之一,而基因定点修饰技术的发展也经历了从早期的基因打靶到三代人工核酸内切酶的过程。第三代人工核酸内切酶 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）/CRISPR-associated（Cas）因其操作简便、成本低廉、作用高效,被广泛应用于生物学研究中的各个领域。目前,CRISPR/Cas9技术多被用于基因编码领域,但是在ncRNA尤其是miRNA中的应用相对较少见报道。miRNA是一类长约22nt,具有广泛生物活性的ncRNA。成熟的miRNA主要通过与靶基因3’UTR上的靶点进行碱基互补配对实现对靶基因的表达调控。miRNA-125a是一种在进化上高度保守的miRNA,它的两个成熟态5p及3p均有生物学功能,我们前期研究显示miRNA-125a参与胚胎植入和复发性流产的发生。本研究以miRNA-125a为切入点,利用CRISPR/Cas9技术构建针对miRNA-125a的定点编辑细胞系及小鼠模型,并从体内和体外分别探究miRNA-125a的功能,主要分为以下四个部分:第一,利用CRISPR/Cas9技术,在人绒毛膜滋养层细胞HTR8-S/Vneo中实现pre-miRNA-125a的基因组片段敲除。首先改造pX458表达载体,引入一组启动子和sgRNA骨架序列,设计sgRNA并检测活性;选取活性较高的载体转染HTR8细胞,流式分选后进行单克隆培养,T7EI酶切筛选阳性单克隆细胞系。鉴定阳性的单克隆细胞系予以测序验证,确认基因组DNA改变情况;并进行细胞功能实验,在细胞层面探究miRNA-125a的功能。研究发现,阳性单克隆细胞系中miRNA-125a-5p及3p的表达量较野生型显著下降,且片段敲除的效果要好于单点敲除;SPACA6基因表达量显著上调;细胞功能实验结果显示,miRNA-125a敲除的HTR8-S/Vneo细胞系增殖能力、迁移能力和成管能力均得到增强。第二,利用CRISPR/Cas9技术,在人绒毛膜滋养层细胞HTR8-S/Vneo中实现pre-miRNA-125a的基因组定点敲入。在基因组中选择合适的拟敲入区域,设计sgRNA并检测活性;选取活性较高的sgRNA,在其切割位点上下游分别扩增1kb左右的同源臂;体外合成启动子及pre-miRNA-125a序列,连接左右同源臂后构建供体载体,与CRISPR表达载体共转染HTR8细胞,流式分选后进行单克隆培养,PCR扩增鉴定阳性单克隆。鉴定阳性的单克隆细胞系予以测序验证,并进行细胞功能实验。研究发现,阳性单克隆细胞系中miRNA-125a-5p及3p的表达量较野生型显著上升;细胞功能实验结果显示,miRNA-125a过表达的HTR8-S/Vneo细胞系增殖能力、迁移能力和成管能力均受到抑制。第三,利用CRISPR/Cas9技术,在C57BL/6J小鼠中实现pre-miRNA-125a的基因组片段敲除。在小鼠基因组中设计一对用于片段敲除的sgRNA,在体外将两条sgRNA转录,与Cas9核酸酶共注射C57BL/6J小鼠受精卵,移入母体内发育成为原代（F0）小鼠;F0小鼠经鉴定与纯化后获得片段敲除的纯合个体。纯合个体取生殖器官进行敲除效率检验及组织切片染色,在组织层面探究miRNA-125a对生殖器官和生殖细胞的影响;同时利用米非司酮构建早期胚胎停育小鼠模型,在个体层面探究miRNA-125a对早期胚胎停育的影响。研究发现,阳性小鼠miRNA-125a-5p及3p的表达量较野生型显著下降,Spaca6基因表达量也有上调趋势;组织层面结果显示,敲除miRNA-125a对卵巢、子宫和睾丸的形态结构未产生显著影响,但使附睾管内容物减少;个体层面结果显示,敲除miRNA-125a对胚胎植入未产生显著影响,但增强了孕鼠对米非司酮诱发流产的敏感性。第四,利用CRISPR/Cas9技术,在C57BL/6J小鼠中实现pre-miRNA-125a的基因组定点敲入。在小鼠基因组中选择合适的拟敲入位点,设计sgRNA并检验活性;构建包含上下游同源臂和pre-miRNA-125a的供体载体;将体外转录出的sgRNA、Cas9核酸酶和Donor DNA共注射C57BL/6J小鼠受精卵,移入母体内发育成为原代（F0）小鼠;F0小鼠经鉴定与纯化后获得定点敲入的纯合个体。纯合个体取生殖器官进行敲入效率检验及组织切片染色,在组织层面探究miRNA-125a对生殖器官和生殖细胞的影响。研究发现,阳性小鼠miRNA-125a-5p及3p的表达量较野生型显著上升,敲入序列的碱基突变会对miRNA的过表达产生影响;组织层面结果显示,过表达miRNA-125a对睾丸的形态结构未产生显著影响,但同样会使附睾管内容物减少。综上所述,我们利用CRISPR/Cas9技术成功构建miRNA-125a定点敲除和敲入的细胞系,并获得了 miRNA-125a定点敲除及敲入的纯合C57BL/6J小鼠。这些研究证实了利用CRISPR/Cas9技术进行miRNAs编辑是有效可行的,利用该模型可继续探究miRNA-125a对生殖妊娠过程的影响及分子机制,具有一定的实践推广价值。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 王瑚
导师: 夏红飞
关键词: 人绒毛膜滋养层细胞,片段敲除,定点敲入
来源: 北京协和医学院
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 北京协和医学院
分类号: Q78
DOI: 10.27648/d.cnki.gzxhu.2019.000629
总页数: 103
文件大小: 9047K
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标签：人绒毛膜滋养层细胞论文; 片段敲除论文; 定点敲入论文;