人血小板第4因子基因启动子报告基因载体的构建及转录活性分析

论文摘要

目的构建人血小板第4因子（PF4）基因启动子-绿色荧光蛋白（GFP）报告基因载体PLVX-PF4-promoter-GFP,并检测其转录活性。方法在NCBI数据库中获得人PF4基因启动子5’端非编码区包含转录起始位点在内的-245～+49 bp的DNA序列。以正常人全血基因组DNA为模板,利用PCR扩增该序列,与GFP序列连接并插入到PLVX-tight-puro载体上,构建重组质粒PLVX-PF4-promoter-GFP。将其包装慢病毒并感染MEG01细胞,用嘌呤霉素筛选出稳转细胞株,并用12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯（PMA）诱导MEG01细胞分化成熟,通过流式细胞术检测GFP表达率,从而验证报告基因的转录活性。结果构建的载体PLVX-PF4-promoter-GFP经酶切鉴定及测序结果比对完全正确,将其转入MEG01细胞,经药物筛选获得了MEG01-PF4-GFP细胞株。流式细胞术检测结果表明,正常培养条件下的MEG01-PF4-GFP细胞中GFP阳性细胞率低[（5.467±0.2603）%],该细胞经PMA诱导分化后,GFP阳性细胞率显著升高[（24.93±2.571）%]。结论成功构建了人PF4启动子-GFP报告基因载体,为后续深入研究PF4基因的调控机制及巨核细胞发育分化的分子生物学机制奠定了基础。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1 .1 材料
•     1 .1.1 基因、质粒、菌株和细胞
•     1 .1.2 试剂和设备
•   1 .2 方法
•     1 .2.1 引物的设计与合成
•     1 .2.2 人PF4基因启动子片段的PCR扩增
•     1 .2.3 重组质粒的构建及鉴定
•     1 .2.4 质粒转染与病毒制备
•     1 .2.5 病毒感染MEG01细胞
•     1 .2.6 MEG01-PF4-GFP细胞株的建立
•     1 .2.7 MEG01细胞诱导分化
•     1 .2.8 细胞多倍体检测
•   1 .3 统计学分析
• 2结果
•   2.1 PF4基因启动子片段和GFP基因片段的PCR扩增
•   2.2重组绿色荧光报告基因质粒的构建
•   2.3 MEG01-PF4-GFP细胞的筛选
•   2.4 PMA对PF4转录活性的影响
•   2.5不同倍性细胞的GFP阳性率
• 3讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 姜佳楠,覃金华,范增,何丽娟,岳文,郑敏,李艳华,裴雪涛

关键词: 血小板因子,巨核细胞,绿色荧光蛋白质类

来源: 军事医学 2019年10期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学

专业: 生物学,基础医学

单位: 电子科技大学医学院,军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所,华南生物医药研究院华南干细胞与再生医学研究中心,军事科学院军事医学研究院卫生勤务与血液研究所

基金: 国家重点研发计划（2017YFA0103100,03,04）,国家自然科学基金（31801227,81872553）,北京市自然科学基金（7194303

分类号: Q78;R346

页码: 733-738

总页数: 6

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