全文摘要
本发明公开了一种同量异位标签试剂，同量异位标签试剂的结构特征包含下式：报告基团‑平衡基团‑活化基团，同量异位标签试剂包含10个化学结构完全相同的标签试剂，在每个标签试剂中的不同位置含有13C或15N同位素，同量异位标签试剂包括：T‑114、T‑115N、T‑115C、T‑116N、T‑116C、T‑117N、T‑118N、T‑117C、T‑118C、T‑119；同时还公开了制备该同量异位标签试剂的方法，还公开了采用该同量异位标签试剂对多肽定量分析方法。本发明中的IBT‑10PLEX采用了新颖的化学结构，降低了制备的难度，提高了产率，从而能够降低产品的成本，扩大同量异位标记法的使用范围。
主设计要求
1.一种多肽定量分析方法，其特征在于：采用同量异位标签试剂，对多肽进行标记并定量；同量异位标签试剂包含10种标签。
设计方案
1.一种多肽定量分析方法，其特征在于：采用同量异位标签试剂，对多肽进行标记并定量；同量异位标签试剂包含10种标签。
2.如权利要求1所述的一种多肽定量分析方法，其特征在于：同量异位标签试剂包含10个化学结构完全相同的标签，在每个标签中的不同位置含有13C或15N同位素，10个标签为：T-114、T-115N、T-115C、T-116N、T-116C、T-117N、T-118N、T-117C、T-118C、T-119。
3.如权利要求2所述的一种多肽定量分析方法，其特征在于：同量异位标签试剂包含MS\/MS可剪切键和含有同位素标签的能够与多肽反应的基团，对多肽进行标记并定量；所述同量异位标签试剂的每个标签的结构包括下式：报告基团-平衡基团–活化基团，其中报告基团和平衡基团通过MS\/MS可剪切键连接，活化基团与多肽的氨基反应形成稳定的酰胺键；每个标签中的报告基团+平衡基团的质量是相同的；含有同量异位标签试剂的具体结构式如下：
设计说明书
技术领域
本发明涉及生物分子分析试剂领域，特别是用于生物分子定量分析，具体为用于蛋白质组学定量的一种同量异位(isobaric)含有10个标签的同量异位标签试剂的制备和应用。
背景技术
目前基于质谱技术检测的蛋白质组学的定量方法，主要包括无标记分析法和标记法，而标记法又分为基于一级质谱(MS1)定量和二级质谱(MS2)定量的方法，其中同量异位同位素标记属于基于MS2的分析方法。
与无标记分析法和MS1标记法相比，MS2标记法优势在于：
1)可以大大降低总体样品的分析时间。
2)由于同量异位标记的不同样品在液相串联(LC-MS\/MS)质谱分析之前被预先混合，使得全部样品在一次LC-MS\/MS分析中完成，有效的降低了不同样品在不同LC-MS\/MS中的系统误差。同量异位素标记方法可以最大限度地减少不同的样本在不同此测量中产生的差异，解决在无标签标记的分析方法中无法避免的重复性问题。
3)多个样品在同量异位试剂标记之后混合在一起，不同样品中所含的同一多肽分子被合并到一起，相当于增强了样品浓度，对应的MS\/MS碎片信号变得更强，使检测的灵敏度大大提高。
4)基于MS1的标记方法，一般在细胞培养基中加入含有稳定同位素标记的氨基酸(SILAC标记法)。与之相比，同量异位MS2标记方法更加简易，减少了前者在色谱分离中的复杂性，更加适用于多个样品的比较分析。
5)基于SILAC标记的定量方法依赖于细胞摄入含稳定同位素的精氨酸或赖氨素合成蛋白，进而再含有这些含有标记氨基酸的蛋白质。这种方法只在培养的细胞中可以实现，但在细菌，动物组织，人体样品的分析中难以应用和实现。与之相比，同量异位同位素MS2标记则不会受样本来源的限制。
显然，同量异位标记法是蛋白质组学定量中最流行的方法之一。然而，市面上现有的商业化的同量异位标记试剂产品价格昂贵，特别是对于大量需要标记的样品，成为许多实验室的经济负担和最大的应用障碍。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种用于MS2碎片标记的同量异位含有10个标签试剂(IBT-10PLEX)的制备和应用。试剂含有10种标记标签可以同时标记10种不同样品，完全适用于多种蛋白质组学的多肽定量分析。
为了达到以上目的，本发明提供如下技术方案：
同量异位标签试剂(IBT-10PLEX试剂)：包含MS\/MS可剪切键和含有同位素标签的能够与多肽反应的基团，对多肽进行标记并定量。其结构包括下式：报告基团-平衡基团-活化基团，其中报告基团和平衡基团通过MS\/MS可剪切键连接。IBT-10PLEX试剂标记多肽的反应以及标记后的多肽在串联质谱中裂解形成的报告基团的结构如下图。
整套试剂包括10个化学结构完全相同的标签试剂，在每个标签试剂中的不同位置含有13C或15N同位素。因此报告基团的质量是不同的，但是报告基团的不同质量被平衡基团所补偿。每个试剂中的报告基团+平衡基团的质量是相同的。报告基团和平衡基团通过可剪切键连接，剪切键在MS\/MS中优先断裂，产生一系列报告基团离子，分别具有不同的分子式和质量，其报告基团离子的具体分子式和精确质量如下：
其对应的化学结构如下，其中星号标记代表同位素15N和13C的位置。
其中所述报告基团的质量在114至119Da的范围内，所述试剂含有独立地选自13C和\/或15N的不同数目和位置的同位素原子组合，并通过质谱进行鉴定分析；鉴定分析步骤如下：
1)采用纳米反相色谱柱进行液相色谱分离；
2)采用Orbitrap Q Exactive高分辨质谱仪对标记的多肽鉴定分析；
3)采用量化分析的信号报告基团离子的信号强度至少为最大峰值的5％。
IBT-10PLEX试剂可以直接对10种多肽样品进行标记。标记完成后混合用于LC-MS\/MS分析。由于报告基团和平衡基团通过质谱MS\/MS可剪切键连接，在串联质谱分析中被切断所形成的报告离子的质量差别可以用高分辨质谱进行分析后用于定量。此外，由于IBT-10PLEX只含有13C和15N同位素，而不含有另一种常用同位素氘，避免了氘引起的相关的色谱位移，确保了定量准确性。
本发明还公开了一种合成7种同位素标签的方法，采用含有不同同位素的原料β-Ala-OBzl，Boc-Gly-OH，丙醛，根据下述方法合成7种同位素标签T-114,T-115N,T-115C,T-116N,T-116C,T-117N,T-118N；
具体步骤如下：
1)化合物1β-Ala-OBzl.HCl和化合物2Boc-Gly-OH偶合成化合物3；
2)化合物3在酸性条件下脱去Boc基团，形成化合物4；
3)化合物4与丙醛在还原剂NaCNBH3作用下形成化合物5；
4)化合物5与氢气在钯碳的催化作用下脱去Bzl保护基团形成化合物6；
5)化合物6在脱水剂EDC的作用下，与NHS形成活化的IBT试剂化合物7；
工艺路线如下：
本发明还公开了合成3种同位素标签的方法，采用含有不同同位素的原料β-Ala-Obzl，Boc-Gly-OH，丙醛，根据下述方法合成3种同量异位标签试剂，包括T-117C,T-118C,T-119；具体步骤如下：
1)2-Nosyl-Gly-OH(化合物8)与碘丙烷反应形成化合物9；
2)化合物9在2-巯基乙醇和氢氧化钾条件下脱保护形成化合物10；
3)在化合物10的二级氨基上加上Boc保护基团形成化合物11；
4)β-Ala-OBzl.HCl(化合物1)和化合物11偶合成化合物12；
5)化合物12在酸性条件下脱去Boc基团，形成化合物13；
6)化合物13与丙醛在还原剂(NaCNBH3)作用下形成化合物5；
7)化合物5与氢气在钯碳的催化作用下脱去Bzl保护基团形成化合物6；
8)化合物6在脱水剂EDC的作用下，与NHS形成活化的IBT试剂化合物7；
IBT-10PLEX试剂的应用：IBT-10PLEX试剂用于多肽定量分析，主要步骤包括标记，分子碎片化、定量三步。最多10个多肽样品可以被IBT-10PLEX试剂分别标记后，混合在一起，然后在液相色谱LC上被分离，进而在MS\/MS中产生特征碎片峰和试剂报告基团，根据特征峰和报告基团的强度对多肽进行定性，定量分析。
其中，多肽通过以下方法获得：
(1)从细胞提取的蛋白
(2)经过胰蛋白酶消化
(3)除盐获得多肽混合物
其中多肽获自细胞培养或者其他样品。
样品的制备可以来自于培养的细胞或其他生物样品中提取的蛋白成分。
本发明还公开了一种同量异位标签试剂，其中同量异位标签试剂同样含有13C和15N的等量异位同位素标签，所述同量异位标签试剂包括下述结构A、结构B、结构C、结构D或者结构E的其中一种或多种：
本发明具有如下有益效果：
本发明中的IBT-10PLEX采用了新颖的化学结构，降低了制备的难度，提高了产率，从而能够降低产品的成本，扩大同量异位标记法的使用范围。
本发明具备所有同量异位试剂固有的高效，高通量，高灵敏的特点，同时改善了其他同类试剂的缺陷，具有低成本性。
本发明的试剂含有10种标记标签可以同时标记10种不同样品，完全适用于多种蛋白质组学的多肽定量分析。
附图说明
图1(A)IBT-10PLEX试剂与肽的比率对标记效率的影响数据图；
图1(B)IBT-10PLEX试剂标记反应时间对标记效率的影响数据图；
图2(A)：IBT-10PLEX标记蛋白定量分析所需的最优的LC-MS\/MS质谱分析条件-分辨率对报告基团离子区分的影响数据图；
图2(B)：IBT-10PLEX标记蛋白定量分析所需的最优的LC-MS\/MS质谱分析条件-NCE(正交碰撞能量)对IBT标记多肽鉴定和IBT报告离子强度的影响数据图；
图3(A)：IBT-10PLEX试剂定量的准确性-IBT-10PLEX标记效率的数据图；
图3(B)：IBT-10PLEX试剂定量的准确性-IBT-10PLEX标记的定量线性范围的数据图；
图3(C)：IBT-10PLEX试剂定量的准确性-IBT-10PLEX标记对不同比例的样品相对定量的准确度数据图；
图3(D)：IBT-10PLEX试剂定量的准确性-复杂样品背景对IBT-10PLEX标记定量的影响程度数据图
图4(A)：IBT-10PLEX试剂用于HeLa细胞中磷酸肽的分析-分析HeLa细胞中磷酸肽的流程图；
图4(B)：IBT-10PLEX试剂用于HeLa细胞中磷酸肽的分析-鉴定和定量的磷酸肽的数量数据图；
图4(C)：IBT-10PLEX试剂用于HeLa细胞中磷酸肽的分析-在不同范围相对丰度变化的磷酸肽的数量；
图4(D)：IBT-10PLEX试剂用于HeLa细胞中磷酸肽的分析-代表性磷酸肽的相对丰度随时间变化的曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明公开了一种同量异位标签试剂IBT-10PLEX试剂，同位素标签试剂包含10个化学结构完全相同的标签试剂，在每个标签试剂中的不同位置含有13C或15N同位素，同位素标签试剂包括：T-114、T-115N、T-115C、T-116N、T-116C、T-117N、T-118N、T-117C、T-118C、T-119。同位素标签试剂包含MS\/MS可剪切键和含有同位素标签的能够与多肽反应的基团，对多肽进行标记并定量；所述同位素标签试剂的结构包括下式：报告基团-平衡基团–活化基团，其中报告基团和平衡基团通过MS\/MS可剪切键连接，活化基团与多肽的氨基反应形成稳定的酰胺键；每个试剂中的报告基团+平衡基团的质量是相同的；含有同位素标签试剂的具体结构式如下：
其中，T-114,T-115N,T-115C,T-116N,T-116C,T-117N,T-118N；
具体步骤如下：
1)化合物1β-Ala-OBzl.HCl和化合物2Boc-Gly-OH偶合成化合物3；
2)化合物3在酸性条件下脱去Boc基团，形成化合物4；
3)化合物4与丙醛在还原剂NaCNBH3作用下形成化合物5；
4)化合物5与氢气在钯碳的催化作用下脱去Bzl保护基团形成化合物6；
5)化合物6在脱水剂EDC的作用下，与NHS形成活化的IBT试剂化合物7；
工艺路线如下：
T-117C,T-118C,T-119采用含有不同同位素的原料β-Ala-Obzl，Boc-Gly-OH，丙醛，具体步骤如下：
1)2-Nosyl-Gly-OH(化合物8)与碘丙烷反应形成化合物9；
2)化合物9在2-巯基乙醇和氢氧化钾条件下脱保护形成化合物10；
3)在化合物10的二级氨基上加上Boc保护基团形成化合物11；
4)β-Ala-OBzl.HCl(化合物1)和化合物11偶合成化合物12；
5)化合物12在酸性条件下脱去Boc基团，形成化合物13；
6)化合物13与丙醛在还原剂(NaCNBH3)作用下形成化合物5；
7)化合物5与氢气在钯碳的催化作用下脱去Bzl保护基团形成化合物6；
8)化合物6在脱水剂EDC的作用下，与NHS形成活化的IBT试剂化合物7；
工艺路线如下：
T-114、T-115N、T-115C、T-116N、T-116C、T-117N、T-118N、T-117C、T-118C、T-119的具体合成路线如下实施例1和实施例2所示，当然了，T-115N、T-115C、T-116N、T-116C、T-117N、T-118N、与T-114的路线一致，T-117C、T-118C、与T-119的路线一致。
实施例1：T-114的合成，合成路线如下：
T-114的合成，合成路线中星号代表相应位置上的13C或者15N。
化合物1(β-Ala-OBzl.HCl，13C3,15N,215mg,1mmol)和化合物2(Boc-Gly-OH,1-13C,175mg,1mmol)溶解在20mL二氯甲烷中，加入EDC.HCl(229mg,1.2mmol),反应在氩气保护下进行20小时，反应液用25mM稀盐酸30mL洗三遍，有机相干燥后用旋转蒸发仪除去，获得283mg油状化合物3(84％产率)。化合物3(283mg)加入50mL HCl的EtOAc溶液(1M)搅拌2小时，出现的白色沉淀过滤收集得到205mg白色固体化合物4(90％产率)。化合物4(205mg)溶解在20mL甲醇中，加入丙醛(162μL,130mg)，然后加入45mg氰基硼氢化钠反应2个小时。用旋转蒸发仪除去甲醇，粗品用二氯甲烷：乙酸乙酯(9：1)在硅胶柱上提纯得到油状化合物5(183mg,76％产率)。化合物5溶解在20mL甲醇中，加入20mg Pd\/C后，在氢气球作用下反应一个小时。除去溶剂得到白色固体化合物6(125mg,95％产率)。化合物6(125mg)溶解在20mL二氯甲烷中，加入EDC(130mg,0.68mmol),NHS(115mg,1mmol),在氩气保护下反应20小时。反应液用20mM碳酸氢钠溶液30mL洗3遍，用饱和盐水30mL洗一遍，有机相干燥后旋干，得到白色固体化合物7(IBT-114,142mg,80％产率)。NMR(400MHz,CD3OD):3.84(m,1H),3.50(m,1H),3.29(s,2H),2.79(m,1H)2.72(s,4H),2.45(m,1H),2.50(m,4H),1.52(m,4H),0.85(t,6H)。ESI-MS(M+H)+(计算)333.20，(实测)333.17。
实施例2：T-119的合成，合成路线如下：
T-119的合成，合成路线中星号代表相应位置上的13C或者15N。
化合物8(Nosyl-Gly-OH,15N,2-13C,524mg,2mmol)溶解在10mL DMF中，加入固体碳酸钠(636mg，6mmol)和碘丙烷(590μL,1.02g,6mmol)，搅拌1小时，过滤白色固体，旋转蒸发除去大部分DMF，加入二氯甲烷30mL,分别用20mM碳酸氢钠水溶液和饱和盐水50mL洗涤3遍，除去二氯甲烷得到654mg白色化合物9(95％产率)。化合物9(654mg)溶解在20mL的KOH\/MeOH饱和溶液中，加入400μL 2-巯基乙醇，反应在氮气保护下搅拌12小时。旋转蒸发除去甲醇。固体剩余物直接溶于10mL水，用稀盐酸调节至pH～10左右，然后，加入氢氧化钠(80mg,2mmol),溶解Boc2O(525mg,2.4mmol)在10mL丙酮中，慢慢滴加入化合物10的水溶液，反应2小时。旋转蒸发除去丙酮，用稀盐酸调节pH～2，乙酸乙酯20mL萃取3次，有机相混合后蒸干得到白色化合物11(350mg,1.62mmol,85％产率)。
化合物1(β-Ala-OBzl.HCl，215mg,1mmol)和化合物11(Nosyl-Gly(Pr)-OH,15N,2-13C,220mg,1mmol)溶解在20mL二氯甲烷中，加入EDC.HCl(229mg,1.2mmol),反应在氩气保护下进行20小时，反应液用25mM稀盐酸30mL洗三遍，有机相干燥后用旋转蒸发仪除去，获得298mg油状化合物12(0.8mmol,80％产率)。化合物12(298mg)加入50mL HCl的EtOAc溶液(1M)搅拌2小时，出现的白色沉淀过滤收集得到230mg白色固体化合物13(0.74mmol,92％产率)。化合物13(230mg)溶解在20mL甲醇中，加入丙醛(13C3,80μL,65mg)，然后加入45mg氰基硼氢化钠反应2个小时。用旋转蒸发仪除去甲醇，粗品用二氯甲烷：乙酸乙酯(9：1)在硅胶柱上提纯得到油状化合物5(160mg,0.52mmol,70％产率)。化合物5溶解在20mL甲醇中，加入20mg Pd\/C后，在氢气球作用下反应一个小时。除去溶剂得到白色固体化合物6(115mg,0.50mmol,96％产率)。化合物6(115mg)溶解在20mL二氯甲烷中，加入EDC(130mg,0.68mmol),NHS(115mg,1mmol),在氩气保护下反应20小时。反应液用20mM碳酸氢钠溶液30mL洗3遍，用饱和盐水30mL洗一遍，有机相干燥后旋干，得到白色固体化合物7(IBT-119,120mg,0.36mmol,72％产率)。NMR(400MHz,CD3OD):3.66(m,2H),3.41(d,1H),3.17(d,1H),2.72(s,4H),2.61(m,3H),2.50(m,2H),2.38(m,1H),1.64(m,1H),1.52(m,2H),1.40(m,1H),0.97(m,1.5H),0.85(t,3H),0.73(m,1.5H)。ESI-MS(M+H)+(计算)333.20，(实测)333.35。
本发明还公开了一种IBT-10PLEX试剂用于多肽定量分析，主要步骤包括标记，分子碎片化、定量三步。最多10个多肽样品可以被IBT-10PLEX试剂分别标记后，混合在一起，然后在液相色谱LC上被分离，进而在MS\/MS中产生特征碎片峰和试剂报告基团，根据特征峰和报告基团的强度对多肽进行定性，定量分析。
其中，多肽通过以下方法获得：
(1)从细胞提取的蛋白
(2)经过胰蛋白酶消化
(3)除盐获得多肽混合物
其中多肽获自细胞培养或者其他样品。
样品的制备可以来自于培养的细胞或其他生物样品中提取的蛋白成分。
具体的定量分析方法如下述实施例3、实施例4、实施例5、实施例6。
实施例3：IBT-10PLEX标记反应条件的优化
图1：IBT-10PLEX标记反应条件的优化。(A)IBT-10PLEX试剂与肽的比率对标记效率的影响。(B)标记反应时间对标记效率的影响。
如图1所示，多肽的有效标记是用同量异位试剂准确定量蛋白的先决条件。通常，可以以鉴定的标记肽数量相对于鉴定的肽的总数量来代表肽的标记率。对于系统优化IBT标记的条件主要包括以下几方面：1)用于溶解多肽混合物的缓冲液TEAB(三乙基碳酸氢铵)浓度，2)标记试剂与多肽样品之间的比例，3)标记时间。经对比得出最佳的标记反应条件为：1)用于溶解多肽样品的TEAB溶液浓度为200mM TEAB溶液；2)IBT-10PLEX试剂与肽的比率为10；3)标记反应最佳时间为2小时。因此，在实际操作中将IBT-10PLEX试剂与溶解在200mM的三乙基碳酸氢铵中的多肽混合，进行标记反应。标记反应在室温下进行反应，2小时后加入三氟乙酸(TFA)终止标记过程，并注射样品到LC-MS\/MS系统中对样品进行分离分析。
实施例4：IBT-10PLEX标记蛋白定量分析所需的最优的LC-MS\/MS质谱分析条件
图2：IBT-10PLEX标记蛋白定量分析所需的最优的LC-MS\/MS质谱分析条件。(A)分辨率对报告基团离子区分的影响。(B)NCE(正交碰撞能量)对IBT标记多肽鉴定和IBT报告离子强度的影响。
如图2所示，IBT-10PLEX标记蛋白定量分析所需的最优的LC-MS\/MS质谱分析条件。液相色谱分离IBT-10PLEX标记后的多肽样品,混合后的样品(可多至10种混合样品),可采用纳米反相(RP)色谱柱(5-μm)Hypersil C18,75μm×150mm，Thermo Fisher Scientific)或者类似功能的色谱柱进行多肽分子分离。IBT-10PLEX报告基团的10种分子标签质量分别在114至119Da范围内，每个试剂标签含有独立的13C和\/或15N的不同数目和位置的组合，不同的同位素分子标签的微小质量差异通过高分辨率质谱进行质量区别，实现分析鉴定和定量。用于量化分析的信号报告离子的信号强度不小于样品最大峰值的5％。
在基于标记的蛋白质组学定量中，质谱的分辨率影响到分离相邻的报告离子(例如，115C对115N)和检测更多肽片段之间的平衡。通过用α-酪蛋白的胰蛋白酶消化物做样品来测试MS2的分析参数，比较得出与其他MS2使用报告相同的结论，即分辨率为350000的串联质谱如用Orbitrap Q Exactive(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)或类似功能高分辨质谱仪对标记的多肽混合物进行鉴定和定量分析效果是最好的。同时，MS2的标准撞击能量NCE的值在24％和36％之间进行了比较分析，结果表明NCE值为30％的时候可以在鉴定多肽的片段和定量的IBT报告基团数量间实现最佳平衡。
实施例5：IBT-10PLEX试剂定量的准确性
图3：IBT-10PLEX试剂定量的准确性。(A)IBT-10PLEX标记效率的评估。(B)IBT-10PLEX标记的定量线性范围。(C)IBT-10PLEX标记对不同比例的样品相对定量的准确度。(D)复杂样品背景对IBT-10PLEX标记定量的影响程度。
如图3所示，1)对于标记效率的评估：采用IBT-10PLEX中10种不同的标签分别标记等量的经胰蛋白酶消化过的Hela细胞提取蛋白。标记后将被不同标签标记的等量的蛋白样品混合，经过LC-MS\/MS鉴定和定量，结果表明，以质量为114的分子标签标记的样品为对照，另外9种分子标签标记的样品量比值均接近1.0。IBT-10PLEX的10种试剂的标记和定量结果之间几乎没有定量偏差。
2)IBT-10PLEX量化级数范围的评估：多个实验证实IBT的量化级数至少达到50倍。
第一个评估实验，牛血清(BSA)的胰蛋白酶消化肽是分别用独立的IBT-10PLEX试剂标记，并按照一定的比率混合在一起,混合比例为为114：115N：115：116N：116C：117N：117C：118N：118C：119＝1：3：9：25：50：1：3：9：25：50。以T-116C作为参考点，报告离子的强度在50倍范围内呈现线性关系，与理论值吻合(斜率＝1.10，R2＝0.97)。
第二个评估实验，HeLa细胞蛋白的胰蛋白酶消化肽分别由每个IBT-10PLEX试剂标记，并且是以不同比例混合：114：115N：115C：116N：116C：117N：117C：118N：118C：119＝3：5：10：1.5：1：1：1.5：10：5：3。以T-117N作为相对参考值，分析后发现大多数样品测量中值接近预期值。
第三个评估实验：采用了大肠杆菌肽作为背景检验复杂样品中A的相对定量结果的影响。BSA的胰蛋白酶肽通过IBT-10PLEX单独标记，以固定比例进行混合，114：115N：115C：116N：116C：117N：117C：118N：118C：119＝1：2：4：8：10：1：2：4：8：10；在比较实验中，混入等量的大肠杆菌肽与BSA一起进行标记，其中BSA的掺入比例仍然为1：2：4：8：10：1：2：4：8：10。两组实验，最终不同标记的样品混合后总肽量相等，并用于LC-MS\/MS分析。在没有引入大肠杆菌肽的组中，量化线性相关性的斜率为0.83，R2值为0.97，而在混有大肠杆菌肽的背景组中，线性拟合的斜率为0.45，R2为0.96。结果显示样品背景杂志会对标签MS信号产生影响。但是，尽管如此，量化仍然是线性的，相关标签MS信号系统性衰减，不影响定量结果。因此IBT在具有复杂背景的系统中进行相对量化是可行的。
实施例6：IBT-10PLEX试剂用于HeLa细胞中磷酸肽的分析
图4：IBT-10PLEX试剂用于HeLa细胞中磷酸肽的分析。(A)分析HeLa细胞中磷酸肽的流程图。(B)鉴定和定量的磷酸肽的数量。(C)在不同范围相对丰度变化的磷酸肽的数量。(D)代表性磷酸肽的相对丰度随时间变化的曲线。
如图4所示，BT-10PLEX试剂用于HeLa细胞中磷酸肽的分析：
1)细胞培养：从ATCC购买的产品HeLa细胞保持在所提供的含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM溶液中，温控37℃，以及保持5％CO2。在无血清培养基中提供细胞含有150ng\/mL的EGF溶液，分别进行1，5,10,15,20,30,40,50和60分钟的刺激培养。之后接触不同EGF刺激的细胞组通过离心收获细胞，并且用PBS洗涤两次以除去剩余的EGF。
2)HeLa细胞蛋白质提取，消化和标签标记：分别取300克从不同组HeLa细胞中提取的蛋白质，经过胰蛋白酶消化和脱盐。与IBT-10PLEX试剂以1：10(w\/w)混合进行标记反应，之后对其中的磷酸肽进行富集提取。
3)磷酸肽的富集和分离：IBT标记的磷酸肽利用表面有TiO2涂层的微球进行富集，通过高pH反相分级分离试剂盒(20mg，Thermo Scientific，Rockford，lL)进行。使用不同的乙腈浓度逐步洗脱(含有三甲胺浓度分别为5,7,8，9，10,11,13,15,17,20,25和50％的乙腈溶剂)。然后合并成6个组分并使用LC-MS\/MS进行分离和鉴定。
4)质谱分析条件：一级MS1扫描范围为350到2000m\/z，扫描分辨率70000,最低信号强度为20000。二级MS\/MS扫描分辨率为35000.最低信噪比设为1.5。
5)数据库搜索：蛋白质鉴定和定量使用iQuant软件利用iPeak搜索(由三个搜索引擎集成MyriMatch v2.2.10165，X！Tandem v2017.2.1.2和MS-GF+v2017.01.13)。蛋白鉴定利用SwissProt人类数据库(2017年4月发布)并decoy序列。具体参数设定为:蛋白和肽的鉴定错误率(FDR)设定为小于1％；选择胰蛋白酶作为特异性酶，每个肽最多含一个错误切割；固定修饰包括IBT-10PLEX(N-term)，IBT-10PLEX(K)，氨基甲酰基甲基化(C)和可变修饰包括氧化(M)，脱氨基(N，Q)，IBT-10PLEX(Y)和磷酸化(S，T，Y)；MS1质量误差值20ppm，MS2片段质量误差0.1Da；只有那些磷酸盐phsophoRS分值超过0.75的确认是磷酸盐,计算磷酸肽定量的pval根据Cauchy分布转换成qval值。
6)IBT-10PLEX试剂定量经EGF刺激的磷酸蛋白表达:磷酸化蛋白质组在EGF不同时间长度(分别为1,5,10,15,20,30,40,50,60分钟)的刺激中产生了磷酸蛋白表达的变化，利用IBT-10PLEX试剂能够同时标记和量化多达10种不同样品的功能，总鉴定蛋白数目为1971个，总鉴别磷酸肽为5361个，其中有确定磷酸化位点的有4882个。
实施例7
本实施例公开了一种新的同量异位标签试剂，同量异位标签试剂含有13C和15N的等量异位同位素标签，同量异位标签试剂包括下述结构A、结构B、结构C、结构D或者结构E的其中一种或多种：
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
设计图
相关信息详情
申请码:申请号:CN201910582411.9
申请日:2019-06-29
公开号:CN110297056A
公开日:2019-10-01
国家:CN
国家/省市:84(南京)
授权编号:授权时间:主分类号:G01N 30/06
专利分类号:G01N30/06;G01N30/72
范畴分类:31E;
申请人:南京谱利健生物技术有限公司
第一申请人:南京谱利健生物技术有限公司
申请人地址:210033 江苏省南京市栖霞区仙林大学城纬地路9号F7栋305室
发明人:李舒伟
第一发明人:李舒伟
当前权利人:南京谱利健生物技术有限公司
代理人:李雪萍
代理机构:32206
代理机构编号:南京众联专利代理有限公司
优先权:关键词:当前状态:审核中
类型名称:外观设计