泛素蛋白酶体系统在传染性支气管炎病毒复制周期中的功能性研究

论文摘要

禽传染性支气管炎（Avian infectious bronchitis,IB）是禽传染性支气管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种鸡的急性、高度接触性呼吸道传染病。IBV属于冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒属（Coronavirus）的γ型冠状病毒,病毒颗粒外包囊膜,内含不分节段的单股正链RNA基因组。泛素蛋白酶体系统简称为UPS（Ubiquitin–Proteasome System）,能够降解错误折叠或受损的蛋白质,从而维持细胞内的蛋白质稳态,同时在细胞周期调控、信号转导、转录调控、细胞凋亡、抗原递呈等许多细胞生理活动中起着关键的作用。目前有不少报道表明病毒的感染依赖于UPS,包括MHV等冠状病毒。然而,UPS对IBV增殖的影响,尚不清楚。本研究以Vero细胞、H1299细胞、和鸡胚胎成纤维细胞DF-1为细胞模型,采用多种方法研究UPS对IBV感染和增殖的作用。一、抑制UPS系统,不利于IBV的感染和增殖IBV感染Vero、H1299、或DF-1细胞,在不同的感染时间点,分别加入蛋白酶体抑制剂MG132、Epoxomicin或Bortezomib,感染后12小时收样,通过Western blot检测病毒蛋白N的表达,并通过荧光定量RT-PCR检测病毒基因组,探讨UPS对病毒增殖的影响。结果表明,在感染后0到6小时加入UPS抑制剂,明显降低病毒蛋白的表达和病毒基因组RNA的水平。之后,将UPS抑制剂处理细胞的时间点精细化,发现抑制剂主要在感染后0到2小时抑制IBV入侵。以猪传染性腹泻病毒PEDV感染Vero细胞,同样发现,在感染后0到2小时加入UPS抑制剂,显著降低病毒的入侵和增殖。以上结果表明,UPS可能在病毒的入侵阶段发挥作用。二、UPS在IBV内吞后和基因组起始翻译之前发挥作用接下来,我们探讨UPS在病毒入侵的哪个阶段发挥作用。IBV的入侵包括吸附、内吞、胞内运输、膜融合、和脱壳。完成脱壳后,以病毒基因组RNA为模板,翻译病毒的开放读码框架（Open Reading Frame,ORF）1a和1ab,合成病毒复制所需要的酶,再对病毒基因组进行复制。在感染后2小时检测内吞的病毒基因组,发现UPS抑制剂并不干扰细胞对病毒的内吞。在感染后5小时检测病毒ORF1a和ORF1ab的翻译,发现UPS抑制剂处理显著降低ORF1a和ORF1ab的翻译。通过嘌呤霉素标记实验,检测细胞内蛋白的合成效率,结果表明UPS抑制剂处理2个小时,并没有显著影响细胞的蛋白翻译效率。因此,ORF1a和ORF1ab的翻译减少,并非由于蛋白翻译效率下降导致。内吞的病毒没有减少,而起始翻译出来的蛋白显著降低,说明UPS抑制剂在病毒内吞之后和基因组复制之前发挥作用,极有可能作用于病毒的胞内运输、膜融合、或脱壳等步骤。三、IBV入胞需要相关蛋白泛素化修饰进一步研究发现,UPS抑制剂处理细胞后,细胞内游离的泛素蛋白单体明显减少,泛素化修饰的蛋白明显增多,说明UPS抑制剂可能通过阻止蛋白降解和泛素蛋白单体的循环利用,耗尽泛素蛋白单体,进而影响相关蛋白的泛素化修饰及其功能,从而影响病毒的感染效率。采用泛素蛋白激活酶E1抑制剂PYR-41处理细胞,抑制相关蛋白的泛素化,发现在IBV感染后0-2小时加入PYR-41,明显降低病毒的增殖,证实了相关蛋白泛素化修饰对病毒入胞的必要性。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 引言
•   1.1 传染性支气管炎概述
•   1.2 传染性支气管炎病毒的生活史
•     1.2.1 吸附
•     1.2.2 内吞
•     1.2.3 胞内运输
•     1.2.4 脱壳
•     1.2.5 复制酶复合物的翻译与组装
•     1.2.6 复制和转录
•     1.2.7 翻译
•     1.2.8 病毒的组装和释放
•   1.3 泛素蛋白酶体系统（UPS）的概述
•     1.3.1 UPS简介
•     1.3.2 泛素化修饰简介
•     1.3.3 蛋白质泛素化修饰类型
•     1.3.4 UPS的功能
•   1.4 UPS与病毒复制之间的相互作用
•     1.4.1 UPS降解细胞内的蛋白质
•     1.4.2 UPS系统降解病毒蛋白
•     1.4.3 病毒蛋白的泛素化和类泛素化修饰
•   1.5 结语
•   1.6 本研究的目的及意义
• 第二章 UPS促进冠状病毒的复制
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 病毒、病毒抗体和细胞
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.2 细胞上清和蛋白样品的收集
•     2.2.3 RNA抽提和RT-PCR
•     2.2.4 SDS-PAGE和蛋白免疫印迹分析（Western blot）
•     2.2.5 细胞毒性的测定
•     2.2.6 扩增IBV
•   2.3 结果
•     2.3.1 不同的UPS抑制剂影响IBV的早期阶段
•     2.3.2 UPS在感染后0-4 小时促进病毒的感染
•   2.4 讨论
• 第三章 UPS在IBV内吞之后,起始翻译之前发挥作用
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 病毒、病毒抗体和细胞
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 主要仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 IBV感染细胞实验
•     3.2.2 细胞上清和蛋白样品的收集
•     3.2.3 SDS-PAGE和蛋白免疫印迹分析（Western blot）
•     3.2.4 RNA抽提和RT-PCR
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 UPS抑制剂不影响病毒的内吞
•     3.3.2 UPS在 IBV起始翻译之前发挥作用
•   3.4 讨论
• 第四章 相关蛋白的泛素化促进IBV入胞
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 病毒、病毒抗体和细胞
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 主要仪器
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 IBV感染细胞实验
•     4.2.2 细胞上清和蛋白样品的收集
•     4.2.3 SDS-PAGE和蛋白免疫印迹分析（Western blot）
•     4.2.4 RNA抽提和RT-PCR
•     4.2.5 PYR-41药物抑制实验
• 50测定'>    4.2.6 TCID₅₀测定
•     4.2.7 外源表达泛素质粒
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 UPS抑制剂处理减少可利用的游离泛素蛋白单体
•     4.3.2 在感染后0-2 小时抑制蛋白泛素化,明显抑制病毒复制
•     4.3.3 外源表达泛素,不影响IBV的入胞和感染效率
•   4.4 讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 袁晓

导师: 廖瑛

关键词: 泛素蛋白酶体系统,感染周期,泛素

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

分类号: S852.65

总页数: 53

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