microRNA-10b-5p对成肌细胞增殖、分化和迁移的遗传作用研究

论文摘要

microRNAs（miRNAs）是一类广泛存在于真核生物中长度约22nt、高度保守的小分子非编码RNA,通常与其靶基因mRNAs的3’UTR区域结合而导致mRNAs降解或抑制其转录后翻译,其几乎参与所有的生物学功能调控。骨骼肌约占个体重的30-40%,是机体新陈代谢的活动中心,也是肉用动物的主要经济性状之一。但是,目前对于miRNAs在骨骼肌发育过程中的表观调控机制还不太清楚。本实验室基于前期高通量测序结果,发现miR-10b-5p在猪骨骼肌中表达量较高,但miR-10b-5p对骨骼肌发育的影响及其调控机制还未见报道。因此,本试验运用C2C12成肌细胞作为研究模型,通过过表达或抑制表达miR-10b-5p来探究其对成肌细胞增殖、分化及迁移的影响作用。并进一步通过双荧光素酶报告系统和小干扰RNA技术验证miR-10b-5p的靶基因以及作用的下游调控网络,明确miR-10b-5p在调控成肌细胞增殖和分化的遗传调控过程中的作用。主要研究结果如下:（1）miR-10b-5p在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、脂肪组织中均有表达,并且肌肉组织中的表达量相对较高。同时,miR-10b-5p的表达量存在一定的时序性,其表达水平在C2C12成肌细胞的增殖过程中逐渐下降,而在其分化过程中显著升高。（2）根据用于测定细胞增殖能力的CCK8和EdU试剂盒测定结果,发现miR-10b-5p能够显著促进C2C12成肌细胞的增殖能力（P<0.01）。在此过程中,miR-10b-5p显著地促进了细胞周期蛋白相关基因表达（CDK4、CyclinE、CyclinD1、CyclinB）（P<0.01）。（3）通过MyHC免疫荧光染色试验发现miR-10b-5p能够显著抑制成肌细胞的肌管生成（P<0.01）,进而降低其成肌分化能力。在此过程中,miR-10b-5p显著地抑制了肌源性分化标志基因（MyHC、MyoD、MyoG、Myf5、MRF4）的表达（P<0.01）。（4）通过细胞划痕试验发现,miR-10b-5p能够显著促进C2C12成肌细胞的迁移能力（P<0.01）。在此过程中,显著地促进了成肌细胞迁移相关功能基因（Pax3、Fhl1和Actg1）的表达（P<0.01）。（5）通过双荧光素酶报告系统的试验结果证明NFAT5和E2F7是miR-10b-5p的直接靶基因。干扰NFAT5的表达,显著抑制了成肌细胞的肌管生成（P<0.01）。而干扰E2F7的表达,则显著地促进了成肌细胞增殖（P<0.01）。上述研究结果表明miR-10b-5p能够促进C2C12成肌细胞的增殖及迁移,同时抑制成肌细胞分化。miR-10b-5p通过直接靶向E2F7和NFAT5调控肌生成相关的增殖和分化过程。这些研究结果表明miR-10b-5p是肌生成过程中的一种重要的表观调控因子与肌肉表型密切相关,本研究为肌肉发育的表观遗传调控研究提供了基础数据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 文献综述
•   1.1 骨骼肌形成概述
•     1.1.1 胚胎期骨骼肌的生长发育
•     1.1.2 出生后骨骼肌的生长发育
•     1.1.3 骨骼肌生长发育相关调控因子
•   1.2 miRNA简述
•     1.2.1 miRNA的形成和作用机制
•     1.2.2 miRNA研究的基本方法
•     1.2.3 miRNA靶基因的预测
•   1.3 miRNA对骨骼肌发育的影响
•     1.3.1 肌肉中特异性表达的miRNA
•     1.3.2 miRNA对肌细胞增殖、分化和迁移的影响
•     1.3.3 miRNA与骨骼肌相关疾病
•   1.4 miR-10b-5p、NFAT5和E2F7的研究现状
•   1.5 本试验研究内容和意义
• 2 材料和方法
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 细胞系、菌株和质粒
•     2.1.2 试验主要试剂
•     2.1.3 试验主要仪器设备
•     2.1.4 组织和细胞总RNA
•     2.1.5 引物合成
•   2.2 主要试验方法
•     2.2.1 生物信息学分析
•     2.2.2 组织和细胞总RNA提取及检测
•     2.2.3 反转录PCR
•     2.2.4 Real-time PCR
•     2.2.5 重组载体构建
•     2.2.6 C2C12细胞培养
•     2.2.7 CCK检测
•     2.2.8 Ed U染色
•     2.2.9 免疫荧光染色
•     2.2.10 细胞划痕试验
•     2.2.11 试验数据统计分析
• 3 结果与分析
•   3.1 miR-10b-5p的组织表达特性
•   3.2 miR-10b-5p在肌细胞中的表达特性
•     3.2.1 miR-10b-5p在C2C12细胞增殖阶段的表达特性
•     3.2.2 miR-10b-5p在C2C12细胞分化阶段的表达特性
•   3.3 miR-10b-5p促进C2C12细胞增殖
•   3.4 miR-10b-5p抑制C2C12细胞分化
•   3.5 miR-10b-5p调控C2C12细胞迁移
•   3.6 miR-10b-5p靶向调控NFAT5
•     3.6.1 miR-10b-5p的靶标预测及双荧光素酶报告系统载体构建
•     3.6.2 miR-10b-5p与NFAT5双荧光素酶报告结果分析
•   3.7 miR-10b-5p靶向NFAT5调控C2C12细胞分化
•     3.7.1 干扰NFAT5不影响C2C12细胞增殖
•     3.7.2 miR-10b-5p靶向NFAT5抑制C2C12细胞分化
•   3.8 miR-10b-5p靶向调控E2F7
•     3.8.1 miR-10b-5p增殖期效应靶基因预测及双荧光素酶报告系统载体构建
•     3.8.2 miR-10b-5p与E2F7双荧光素酶报告结果分析
•   3.9 miR-10b-5p通过靶向E2F7调控C2C12细胞增殖
• 4 讨论
•   4.1 miR-10b-5p通过靶向E2F7调控C2C12细胞增殖
•   4.2 miR-10b-5p通过靶向NFAT5调控C2C12细胞分化
•   4.3 miR-10b-5p不能通过靶向NFAT5调控C2C12细胞增殖
•   4.4 miR-10b-5p促进C2C12细胞迁移
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 葛桂华

导师: 朱砺

关键词: 成肌细胞

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 四川农业大学

基金: “十三五”四川省科技支撑计划课题“猪遗传资源发掘与利用研究”(课题编号:2016NYZ0050)

分类号: Q952.5

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000916

总页数: 71

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