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外泌体介导的口蹄疫病毒感染机制研究

2020-12-02阅读(717)

外泌体介导的口蹄疫病毒感染机制研究

论文摘要

外泌体（exosomes）是一类能够转运蛋白、脂质和核酸等物质的胞外双层膜囊泡。病毒感染后,宿主细胞分泌的外泌体携带有病毒或宿主细胞活性成分,该外泌体参与调控病毒感染或者宿主免疫反应。口蹄疫病毒（FMDV）感染后,宿主细胞分泌的外泌体在FMDV感染中的作用及机制尚不清楚。本研究以FMDV感染细胞释放的外泌体（FMDV-exosomes）与未感染细胞释放的外泌体（MOCK-exosomes）为研究对象,揭示FMDV-exosomes在FMDV感染中的作用及机制,主要内容如下:1.FMDV-exosomes的分离鉴定及成分分析本研究使用FMDV（A/GDMM/CHA/2013）感染猪肾传代细胞PK-15,收集感染细胞上清,使用差速离心结合免疫纯化的方法分离纯化FMDV-exosomes;使用蛋白质免疫印迹（WB）,透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）三种方法检测分离纯化产物,结果均符合外泌体定义,证实分离到该外泌体。将FMDV基因组分成7个片段,提取FMDV-exosomes中RNA,RT-PCR可以成功扩增到7个片段,证明FMDV-exosomes中含有全长FMDV核酸序列。使用液相二级质谱（LC-MS/MS）鉴定FMDV-exosomes蛋白表达谱,共鉴定到1133个宿主蛋白和9个FMDV蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4、2B、2C、3A、3C、3D）;同时使用稳定表达CD63-GFP的PK-15细胞株验证质谱结果,发现绿色荧光（外泌体）中包裹有红色荧光（FMDV-VP3）,证明FMDV-exosomes中含有FMDV蛋白。2.FMDV-exosomes与FMDV感染使用DiO标记（绿色）FMDV-exosomes,将其孵育PK-15细胞,共聚焦显微镜观察到胞内有绿色荧光,证明分离的FMDV-exosomes能够进入宿主细胞。将FMDV-exosomes接种PK-15和IBRS-2细胞,FMDV-exosomes均能使两种细胞产生病变,且qRT-PCR能检测到病毒复制,证明FMDV-exosomes能够感染FMDV易感细胞。将FMDV-exosomes接种RAW264.7细胞,qRT-PCR检测到病毒复制,证明FMDV-exosomes能够侵染FMDV非易感细胞。使用FMDV中和抗体处理FMDV-exosomes,将其孵育PK-15细胞,FMDV-exosomes仍然能够感染PK-15细胞,证明FMDV-exosomes感染细胞能力不受中和抗体影响。为进一步验证FMDV-exosomes致病性,将FMDV-exosomes接种3日龄Balb/C乳鼠,48 h出现乳鼠死亡现象,且检测到FMDV复制,证实FMDV-exosomes内的FMDV成分能够在体内复制。3.FMDV-exosomes与FMDV复制使用BCA蛋白浓度检测方法定量FMDV-exosomes与MOCK-exosomes总蛋白量,将等量样品分别孵育PK-15细胞,接种FMDV,qRT-PCR检测发现孵育FMDV-exosomes组FMDV载量更低。使用si-Rab27a干扰宿主蛋白Rab27a（抑制外泌体分泌）,接种FMDV,qRT-PCR检测发现胞内胞外病毒载量均比对照组高;使用0、5、10μmol/L GW4869（抑制外泌体形成）处理细胞,接种FMDV,qRT-PCR检测发现胞内胞外病毒载量均比对照组高,且呈剂量依赖性。上述结果证明FMDV-exosomes抑制FMDV复制,减少外泌体分泌量有利于FMDV复制。为探究FMDV-exosomes通过何种途径抑制病毒复制,将FMDV-exosomes分别接种PK-15、Vero、RAW264.7细胞,发现FMDV-exosomes在三种细胞上均能上调TNF-α转录。4.FMDV复制与外泌体释放使用WB方法检测FMDV感染组与未感染组外泌体标志蛋白表达量,采用BCA蛋白浓度检测方法定量外泌体总蛋白量,均发现FMDV感染组分离到的外泌体相比未感染组少,证明FMDV复制降低了外泌体分泌量。将FMDV接种PK-15细胞,结果证实随着FMDV复制,宿主蛋白Rab27a降解增多;分别使用CQ、NH4Cl、Z-VAD-FMD、MG132四种蛋白降解抑制剂处理PK-15,然后接种FMDV,发现CQ（抑制自噬溶酶体途径）处理后,FMDV不能有效降解Rab27a;以上结果证明FMDV通过自噬溶酶体途径降解Rab27a。WB检测发现过表达Rab27a后再接种FMDV,外泌体分泌量没有减少,证明FMDV通过降解Rab27a抑制外泌体分泌。同时,WB检测发现过表达Rab27a抑制了FMDV复制,说明FMDV通过抑制外泌体分泌从而促进FMDV复制。过表达FMDV 12个编码蛋白,发现FMDV-2C降解宿主蛋白Rab27a,且呈剂量依赖性。进一步研究发现FMDV-2C能够降低外泌体分泌量。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语表
  • 1 文献综述
  •   1.1 口蹄疫研究进展
  •     1.1.1 口蹄疫病毒
  •     1.1.2 口蹄疫病毒致病机制
  •     1.1.3 口蹄疫病毒拮抗宿主天然免疫机制
  •   1.2 外泌体研究进展
  •     1.2.1 外泌体形成
  •     1.2.2 外泌体分泌
  •     1.2.3 外泌体摄取
  •     1.2.4 外泌体与病毒感染
  • 2 本研究目的与意义
  • 3 材料与方法
  •   3.1 材料
  •     3.1.1 毒株、细胞和质粒
  •     3.1.2 试剂耗材
  •     3.1.3 试验动物
  •     3.1.4 重要仪器与设备
  •     3.1.5 分子生物学和生物信息分析软件
  •     3.1.6 主要溶液的配制
  •     3.1.7 试验地点
  •   3.2 方法
  •     3.2.1 HA-Rab27a真核表达质粒构建
  •     3.2.2 稳定表达CD63-GFP的 PK-15 细胞系构建
  •     3.2.3 口蹄疫病毒血清中和抗体效价测定及中和抗体纯化
  •     3.2.4 外泌体分离纯化与示踪
  •     3.2.5 外泌体鉴定
  •     3.2.6 外泌体定量方法
  •     3.2.7 其它分子生物学实验方法
  • 4 结果与分析
  •   4.1 HA-Rab27a真核表达质粒及PK-15-CD63-GFP细胞系构建
  •     4.1.1 Rab27a真核表达质粒构建及验证
  •     4.1.2 PK-15-CD63-GFP稳转细胞系构建及初步应用
  •   4.2 口蹄疫病毒感染细胞释放的外泌体的分离、纯化与鉴定
  •     4.2.1 口蹄疫病毒感染PK-15 细胞
  •     4.2.2 FMDV-exosomes分离、纯化与鉴定
  •   4.3 FMDV-exosomes成分鉴定
  •     4.3.1 FMDV-exosomes中含有口蹄疫病毒全长基因
  •     4.3.2 FMDV-exosomes质谱鉴定
  •     4.3.3 外泌体分泌是口蹄疫病毒释放途径之一
  •   4.4 FMDV-exosomes介导口蹄疫病毒的感染
  •     4.4.1 FMDV-exosomes能够进入宿主细胞
  •     4.4.2 FMDV-exosomes对口蹄疫病毒易感细胞具有感染性
  •     4.4.3 FMDV-exosomes能够在口蹄疫病毒非易感细胞上增殖
  •     4.4.4 FMDV-exosomes能够在乳鼠体内复制并致死乳鼠
  •     4.4.5 FMDV-exosomes感染易感细胞的能力不受中和抗体影响
  •   4.5 FMDV-exosomes抑制口蹄疫病毒复制
  •     4.5.1 外源FMDV-exosomes抑制口蹄疫病毒复制
  •     4.5.2 抑制外泌体形成与分泌有利于口蹄疫病毒复制
  •     4.5.3 FMDV-exosomes能够激活TNF-α转录
  •   4.6 口蹄疫病毒通过降解宿主蛋白Rab27a抑制外泌体分泌
  •     4.6.1 口蹄疫病毒复制致外泌体分泌量减少
  •     4.6.2 口蹄疫病毒通过降解Rab27a进而抑制外泌体分泌
  •     4.6.3 口蹄疫病毒2C蛋白抑制外泌体分泌
  • 5 讨论
  •   5.1 外泌体分离纯化
  •   5.2 外泌体介导的口蹄疫病毒体内、体外感染
  •   5.3 FMDV-exosomes抑制口蹄疫病毒复制
  •   5.4 口蹄疫病毒抑制外泌体分泌
  • 6 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 徐守兴

    导师: 吴斌

    关键词: 口蹄疫病毒,细胞,外泌体,感染机制

    来源: 华中农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 华中农业大学

    基金: 科技部“十二五”农村领域国家科技支撑计划:口蹄疫等重要家畜疾病防控净化技术集成研究与示范(2015BAD12B04),国家自然科学基金:口蹄疫病毒VP1蛋白介导宿主核糖体蛋白SA调控MAPK信号通路的分子机制(31572542),家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放基金:仔猪口蹄疫母源抗体保护效力及其对疫苗首次免疫的干扰(SKLVEB2017KFKT001)

    分类号: S852.65

    DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000402

    总页数: 65

    文件大小: 4686K

    下载量: 151

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