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CHO细胞定点整合稳定表达治疗性蛋白质的研究

2020-12-02阅读(558)

CHO细胞定点整合稳定表达治疗性蛋白质的研究

论文摘要

中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞是首个被美国FDA、欧盟EMA和中国CFDA认可的用于生物制药领域的生产细胞,已广泛应用于各种治疗性蛋白质药物的大规模制备。CHO细胞在治疗性蛋白质药物生产中的优势明确,但目前构建重组的生产型CHO细胞株还一直停留在目的基因随机整合,或基于外源基因倍增策略,通过筛选高表达细胞,以最终获得工程化表达细胞的研究思路。这导致建立的生产型CHO细胞株的表达性状的长期稳定性欠缺,构建生产型细胞株的效率低等问题。本研究以具有抗凋亡能力的CHO细胞株为研究材料,通过对稳定表达外源性基因位点的确认,构建了可以表达不同类型治疗性重组蛋白质的CHO表达细胞株,并对不同蛋白质类药物的表达稳定性进行了认证,主要结果如下:（1）以CHO-K1细胞系为研究材料,采用CRISPR/Cas9技术,通过CD513B-Cas9、sgRNA-BAK与sgRNA-BAX三个表达质粒一次性共转染,实现了对出发细胞凋亡相关基因的敲除。DNA序列测序发现实验细胞的目标靶点处序列均有明确的插入/删除;检测实验细胞均不再表达BAK与BAX蛋白质。对比野生型CHO-K1细胞,发现构建的BAK-/BAX-CHO-K1细胞在抗凋亡能力方面有明显的优势。其中野生型CHO-K1细胞在5 mg/L细胞凋亡促进试剂嘌呤霉素处理48小时后,细胞的晚期凋亡比例从13.3%增加到了41.3%,而获得的3个BAK-/BAX-CHO-K1细胞克隆的晚期凋亡比例维持在14%19%。选取BAK-/BAX-CHO-K1（1d4）单克隆细胞与CHO-K1细胞,经悬浮驯化,进行批次培养,CHO-K1与BAK-/BAX-CHO-K1细胞可达到的最高密度（6×106cells/mL）相近;相较于CHO-K1细胞,BAK-/BAX-CHO-K1细胞可以在长达8天的批次培养条件下,维持着至少达83%以上的活率,而CHO-K1细胞在第4天的活率不足82%,在之后的2天培养时间内,活率持续下降到72%左右水平;这显示出了BAK-/BAX-CHO-K1更耐受凋亡并能维持更长时间稳定培养的特点。通过新技术的应用和共转染方法的改进,避免了经典方法中繁琐的敲除验证,以及再次敲除再次验证的实验步骤,提升了敲除目标基因的成功率,达到了构建具有抗凋亡遗传表型和功能实现的BAK-/BAX-CHO-K1细胞的目的,具备了作为本文后续研究中的起始出发细胞的工作要求。（2）以BAK-/BAX-CHO-K1细胞株为研究材料,组合应用了慢病毒示踪报告基因技术和染色体步移技术,通过对相关方法的实验适应性改进,寻找到6个绿色荧光标签稳定整合的BAK-/BAX-CHO-K1细胞基因组内位点。DNA序列测序明确了整合位点的序列（NW006882077.1第691045碱基处,NW006883358.1第6874389碱基处,NW006880285.1第1235357碱基处,NW003613638.1第1969647碱基处,NW006884764.1第66645碱基处,NW006882456.1第1020651碱基处）。结合CHO-K1细胞系基因组二代测序数据预测整合位点所在区域的基因拷贝数,随机选择了NW006880285.1第1235357处整合位点的单克隆细胞,对其表达绿色荧光标签的稳定性进行了系统研究。实验单克隆细胞在50代次传代过程中均100%稳定表达该外源基因的表型,细胞平均荧光强度值一直保持稳定。悬浮驯化实验单克隆细胞,超过98%的细胞持续稳定表达绿色荧光标签蛋白质Zsgreen1。被驯化的悬浮细胞经过50代次传代,93%-94%的细胞继续稳定表达绿色荧光基因,平均荧光强度稳定。通过技术集成和方法学改进,成功开发出了一种新型的寻找CHO-K1细胞系胞内稳定表达外源基因整合位点的方法,结合相应的功能实验,确认了该实验细胞内适于外源基因稳定表达的整合位点。（3）基于已找到的慢病毒位点信息,结合CCTOP CRISPR/Cas9在线预测系统,确定了CHO细胞内具体可供外源基因定点整合的位点:NW00688025.1上第1235284-1235429碱基处。根据整合位点的序列和结构特征,设计并构建了3种不同治疗性蛋白质基因的供体质粒。3种供体质粒均包含完整的目的基因打靶盒和下游的完整筛选打靶盒（嘌呤霉素抗性基因及红色荧光基因）,用于定点整合实验过程中的正筛选。在上述两个打靶盒外侧分别加上含600 bp大小的同源臂,并在5’同源臂上游设计了完整的绿色荧光打靶盒,用于定点整合实验过程中的负筛选。分别共转染Cas9-DTU表达质粒、sgRNA表达质粒和不同治疗性蛋白质目的基因的供体质粒于CHO细胞后,获得了1个靶向VEGF人源化抗体（VEGF-hAb,150 kDa）轻重链基因定点整合的单克隆细胞,3个胰高血糖素样肽-1突变双联体-人血清白蛋白质（NGGH,75 kDa）基因定点整合的单克隆细胞,2个人血清白蛋白质（HSA,68 kDa）基因定点整合的单克隆细胞,获得的上述定点整合细胞均为杂合子。NGGH基因定点整合细胞于贴壁状态下传代,目的蛋白质表达水平趋于1.2 pg/cell/day,HSA基因定点整合细胞目的蛋白质表达水平趋于0.8 pg/cell/day,VEGF-hAb基因定点整合细胞目的蛋白质表达水平趋于0.007 pg/cell/day。这些定点整合细胞悬浮驯化后,批次培养6天,在不同代次下,表达水平分别稳定在17 mg/L、13 mg/L及2.5μg/L。最后,转录过程并不是造成抗体表达水平显著低于另两种重组蛋白质表达水平的原因:VEGF-hAB表达细胞株轻链基因转录水平为NGGH表达细胞株NGGH基因的48.9%,而重链基因转录效率为NGGH基因的56.1%。实验设计的供体质粒可保证目的基因被完整定点整合于细胞基因组内;实验结果显示了CHO细胞NW00688025.1上第1235284-1235429碱基处,在整合了不同分子量大小的外源基因后,可以完整地、长期稳定表达治疗性抗体蛋白质、治疗性融合蛋白质和人血清白蛋白质,揭示了外源基因整合于该位点后,在长期传代过程中不会丢失,并可稳定表达。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 英文缩略词
  • 第一章 绪论
  •   1.1 中国仓鼠卵巢细胞简介
  •     1.1.1 中国仓鼠卵巢细胞的历史与生物制药领域常用的中国仓鼠卵巢细胞介绍
  •     1.1.2 CHO表达体系的优势
  •     1.1.3 传统CHO表达细胞株构建方法概述
  •     1.1.4 CHO表达体系存在的问题
  •   1.2 基因编辑与CRISPR/CAS9 技术
  •   1.3 本文研究背景和内容
  •     1.3.1 研究背景
  •     1.3.2 研究内容
  • 第二章 BAK/BAX双基因敲除CHO细胞株的构建
  •   2.1 前言
  •   2.2 实验材料与仪器
  •     2.2.1 实验材料
  •     2.2.2 实验仪器
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 SgRNA表达质粒构建与鉴定
  •     2.3.2 CHO-K1 细胞的培养
  •     2.3.3 靶点可敲除性验证
  •     2.3.4 单克隆细胞分离与DNA序列验证
  •     2.3.5 BAK/BAX蛋白质检测
  •     2.3.6 抗凋亡功能验证
  •     2.3.7 悬浮细胞批次培养时细胞密度及活率检测
  •     2.3.8 潜在脱靶位点验证
  •   2.4 结果与讨论
  •     2.4.1 重组表达质粒sgRNA-BAK与 sgRNA-BAX的构建
  •     2.4.2 靶点可敲除性验证
  •     2.4.3 BAK-/BAX-CHO-K1 单克隆细胞DNA序列检测
  •     2.4.4 BAK-/BAX-CHO-K1 单克隆细胞蛋白质检测
  •     2.4.5 BAK-/BAX-CHO-K1 单克隆细胞功能验证
  •     2.4.6 悬浮细胞批次培养时细胞密度及活率检测
  •     2.4.7 潜在脱靶位点的实验验证
  •   2.5 小结
  • 第三章 BAK-/BAX-CHO-K1 细胞基因组内稳定表达位点的筛选
  •   3.1 前言
  •   3.2 实验材料与仪器
  •     3.2.1 实验材料
  •     3.2.2 实验仪器
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 慢病毒的包装与滴度检测
  •     3.3.2 慢病毒感染与稳定细胞株构建
  •     3.3.3 染色体步移
  •     3.3.4 表达报告基因的细胞株传代稳定性
  •     3.3.5 表达报告基因的细胞株悬浮驯化稳定性
  •   3.4 结果与讨论
  •     3.4.1 慢病毒的构建
  •     3.4.2 慢病毒感染后的稳定细胞株构建
  •     3.4.3 稳定细胞株慢病毒整合位点的确定
  •     3.4.4 单克隆细胞株2c3 表达报告基因的传代稳定性
  •     3.4.5 单克隆细胞株2c3 表达报告基因悬浮驯化稳定性
  •   3.5 小结
  • 006880285.1第1235357 碱基处定点整合表达治疗性蛋白质'>第四章 基于CHO基因组内NW006880285.1第1235357 碱基处定点整合表达治疗性蛋白质
  •   4.1 前言
  •   4.2 实验材料与仪器
  •     4.2.1 实验材料
  •     4.2.2 实验仪器
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 定点整合位点的确定
  •     4.3.2 治疗性蛋白质基因供体质粒的构建
  •     4.3.3 转染细胞池的获得
  •     4.3.4 细胞池内定点整合基因的鉴定
  •     4.3.5 单克隆细胞中定点整合基因的鉴定
  •     4.3.6 细胞培养上清液中目标蛋白质的鉴定
  •     4.3.7 贴壁细胞表达目的蛋白质水平检测
  •     4.3.8 悬浮细胞表达目的蛋白质水平检测
  •     4.3.9 各悬浮细胞目的基因转录水平检测
  •   4.4 结果与讨论
  •     4.4.1 潜在定点整合位点的确定
  •     4.4.2 潜在脱靶位点的验证
  •     4.4.3 VEGF-hAB轻重链基因、NGGH基因与HSA基因供体质粒的构建
  •     4.4.4 细胞池内定点整合基因的鉴定
  •     4.4.5 VEGF-hAB轻重链基因、NGGH基因与HSA基因定点整合单克隆细胞株的鉴定与培养
  •     4.4.6 定点整合与随机整合方法学对比
  •     4.4.7 定点整合单克隆细胞株培养上清液中蛋白质鉴定
  •     4.4.8 细胞贴壁状态下目的蛋白质的表达
  •     4.4.9 细胞悬浮培养状态目的蛋白质的表达
  •     4.4.10 各悬浮细胞目的基因转录水平检测
  •   4.5 小结
  • 主要结论与展望
  •   主要结论
  •   展望
  • 论文主要创新点
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文及专利
  • 附录:测序数据

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 周松涛

    导师: 李华钟

    关键词: 中国仓鼠卵巢细胞,定点整合,治疗性蛋白质药物,抗凋亡,慢病毒随机整合,染色体步移

    来源: 江南大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 江南大学

    分类号: Q78

    总页数: 108

    文件大小: 5571K

    下载量: 328

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