菊糖蔗糖酶的性质鉴定及分子改造研究

论文摘要

自然界中存在两种果聚糖,按照糖苷键型的差异可分为菊糖和levan型果聚糖。菊糖在一些菊科植物中含量丰富,具有许多优异的性质和生理功能,已被作为可溶性膳食纤维,应用于食品、医药等许多领域。目前,工业化的菊糖大多来自植物菊苣,相反,levan型果聚糖主要来自微生物,植物中含量很少。国内尚没有关于微生物来源菊糖的报道,实际上,一些微生物可通过菊糖蔗糖酶（Inulosucrase,EC:2.1.4.9）以蔗糖为唯一底物,一步合成菊糖。众所周知,多糖的分子量是影响其性质和功能的关键因素,而微生物菊糖与植物菊糖的主要不同在于分子量,微生物菊糖的分子量一般在106 g/mol以上,是植物菊糖的百倍。即使如此,微生物菊糖及菊糖蔗糖酶仍未得到足够的重视。本课题鉴定了一种来源于乳酸菌L.gasseri DSM 20604的菊糖蔗糖酶,并对酶学性质和产物多糖的键型进行鉴定。之后,对菊糖合成条件进行优化。最后,通过定点突变获得了使酶活和稳定性提高的正突变。本课题利用不同的N-端截断方式构建重组菊糖蔗糖酶。相应的截断基因插入进载体pET-22b（+）中,构建重组质粒。重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）内,IPTG诱导重组酶的过量表达。通过检测两种截断的菊糖蔗糖酶在最适pH和温度下的活力表明:不同的N-端截断方式仅改变了菊糖蔗糖酶的最适pH和温度,对酶活的影响不大。酶学性质鉴定表明,Laga-ISase（截断信号肽、N-端的101个氨基酸和C-端）总酶活的最适pH和最适温度分别为pH 5.5和35℃。大部分二价金属离子对Laga-ISase酶活有促进作用,其中Mn2+可以将酶活提高至157%。热稳定性研究表明,45℃保温3 h,残余酶活仍保持为原始酶活的84%,为目前已经鉴定的菊糖蔗糖酶中热稳定性最高的。结构稳定性研究表明,Laga-ISase的变性温度为55℃。对Laga-ISase的反应动力学研究表明,该酶的总酶活和转糖苷酶活的反应动力学行为不遵循米氏方程。而水解酶活符合米氏方程底物饱和的典型特点,且水解酶活的Km为44.12 mmol/L。通过傅里叶变换红外光谱和核磁共振检测产物多糖的糖苷键型,确定产物为β-（2,1）糖苷键连接的菊糖。以30%蔗糖为底物,对酶法合成菊糖的条件进行优化,获得菊糖合成的最适加酶量和时间分别为:4.5 U/g蔗糖和1.5 h。在最适条件下,获得的菊糖的分子量为5.86′106g/mol。之后,通过分子生物学手段结合计算模拟和理性设计,获得13个定点突变的突变体。通过对突变体酶的活力和结构稳定性进行研究,发现了对酶活和结构稳定性起重要作用的关键位点。其中,Q196E的总酶活和Tm值分别降低至野生酶的37.8%和54.2℃,这表明残基Gln196对酶的活力和结构稳定性具有重要作用。另外,获得了使酶活提高的正突变,突变体D288E的酶活为野生酶的131.5%。大部分突变体的Tm值增加,其中A310E、S346A、I478M和A491S的Tm值分别较野生酶提高了1.38、1.39、1.83和1.31℃。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1.绪论
•   1.1 果聚糖简介
•   1.2 菊糖概述
•     1.2.1 菊糖的分类及植物来源
•     1.2.2 菊糖的理化性质及应用
•     1.2.3 菊糖的代谢及生理功能
•   1.3 菊糖的生物合成
•     1.3.1 菊糖合成酶
•     1.3.2 菊糖蔗糖酶的微生物来源
•     1.3.3 菊糖蔗糖酶的酶学性质
•     1.3.4 菊糖蔗糖酶的晶体结构
•     1.3.5 菊糖蔗糖酶的催化机制
•   1.4 本课题的立题背景及意义
•   1.5 研究思路与主要内容
• 2.材料与方法
•   2.1 实验材料与仪器
•     2.1.1 菌种和质粒
•     2.1.2 主要实验试剂
•     2.1.3 主要实验仪器
•   2.2 培养基和试剂的配置
•     2.2.1 培养基
•     2.2.2 Lowry法测蛋白浓度相关试剂
•     2.2.3 电泳相关试剂
•     2.2.4 蛋白纯化相关试剂
•     2.2.5 HPLC流动相
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 重组质粒的构建
•     2.3.2 E.coil感受态细胞的制备
•     2.3.3 重组E.coil的构建
•     2.3.4 重组菌的保存
•     2.3.5 重组质粒的提取
•     2.3.6 琼脂糖凝胶电泳
•     2.3.7 重组酶的诱导表达
•     2.3.8 重组酶的纯化
•     2.3.9 重组酶单亚基分子量测定
•     2.3.10 重组酶全分子量测定
•     2.3.11 重组酶浓度的测定
•     2.3.12 酶活测定
•     2.3.13 酶学性质研究
•     2.3.14 酶法合成菊糖的产物鉴定
•     2.3.15 酶法合成菊糖的条件优化
•     2.3.16 Laga-ISase的分子改造
• 3.结果与讨论
•   3.1 L.gasseri DSM20604 菊糖蔗糖酶的生物信息学分析
•   3.2 L.gasseri DSM20604 菊糖蔗糖酶的异源表达及分离纯化
•   3.3 酶浓度及酶反应产物检测
•   3.4 N-端截断方式对酶活的影响
•     3.4.1 pH对 Laga-ISase和 Laga+101 酶活的影响
•     3.4.2 温度对Laga-ISase和 Laga+101 酶活的影响
•   3.5 Laga-ISase酶学性质研究
•     3.5.1 金属离子对Laga-ISase酶活的影响
•     3.5.2 Mn2+浓度对Laga-ISase酶活的影响
•     3.5.3 Laga-ISase的热稳定性
•     3.5.4 Laga-ISase的结构稳定性
•     3.5.5 Laga-ISase的反应动力学研究
•   3.6 酶法合成菊糖的产物鉴定
•     3.6.1 FTIR分析
•     3.6.2 NMR分析
•     3.6.3 产物菊糖分子量鉴定
•   3.7 菊糖合成条件的优化
•     3.7.1 加酶量的优化
•     3.7.2 底物浓度的优化
•     3.7.3 菊糖合成的反应进程
•   3.8 Laga-ISase分子改造研究
•     3.8.1 Laga-ISase的结构模拟
•     3.8.2 Laga-ISase模拟结构的质量评测
•     3.8.3 突变体酶的分离纯化
•     3.8.4 突变体的酶活研究
•     3.8.5 突变体的结构稳定性研究
• 主要结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录一 ：作者在攻读硕士期间发表的论文
• 附录二

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 倪大伟

导师: 沐万孟

关键词: 菊糖,菊糖蔗糖酶,端截断,酶学性质,分子改造

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ929

总页数: 66

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