导读:本文包含了磷酸化位点论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:磷酸化,蛋白,缝隙,转染,细胞,线粒体,氧化氮。
磷酸化位点论文文献综述
韩瑞才,徐志荣,何汛锋,石庆华,吴自明[1]（2019）在《硝酸还原酶磷酸化位点S_(532)定向突变增强水稻幼苗的耐冷性》一文中研究指出【研究背景】硝酸还原酶(Nitrate reductase, NR)是植物体内同化硝态氮的关键酶,其活性受翻译后磷酸化修饰调控,由光向暗NR活性迅速降低,减少了植株对硝态氮的吸收与同化。因此,研究水稻硝酸还原酶活性的磷酸化调控机制对提高水稻硝态氮同化能力和氮素利用率具有重要的实践意义。【材料与方法】以硝酸还原酶磷酸化位点S_(532)定向突变(Nia1-S_(532)-D、Nia1-S_(532)-A)和Nia1转基因株系为材料,研究了S_(532)定向突变对NR活性的影响,同时对低温胁迫(8℃)下水稻幼苗表型、叶绿素含量、氮素的吸收利用(NO_3~-、NO_2~-、NH_4~+和游离氨基酸含量)、NR活性及活性氧代谢等生理生化指标进行测定分析。【结果与分析】S_(532)定向突变株系NR活性状态基本保持稳定,打破了内源NR活性变化的昼夜节律,Nia1转基因株系NR活性状态的日变化呈现先升高后降低的趋势;S_(532)定向突变株系NR活性高于Nia1转基因株系。正常生长条件下,S_(532)定向突变株系的株高、根长、干重和叶绿素含量均低于Nia1转基因株系;低温处理6d,S_(532)定向突变转基因株系的株高、根长、干重和叶绿素含量与Nia1转基因株系之间的差异减小;常温恢复生长3d后,S_(532)定向突变转基因株系的株高、干重和叶绿素含量高于Nia1转基因株系。对NR活性、氮素的吸收利用和活性氧代谢分析表明,与Nia1转基因株系相比,正常生长条件下S_(532)定向突变株系NR活性升高,NO_2~-积累量增加约3倍,H_2O_2和MDA含量显着增加;低温胁迫下S_(532)定向突变株系和Nia1转基因株系的NR活性和NO_2~-积累量降低,NO_3~-、NH_4~+和游离氨基酸含量升高;低温胁迫后恢复生长3d,S_(532)定向突变株系NO_2~-、H_2O_2和MDA含量与Nia1转基因株系无显着差异,NH_4~+和游离氨基酸的含量显着增加。【结论】正常生长条件下,硝酸还原酶磷酸化位点S_(532)定向突变造成的NR活性状态的改变和活性的升高加剧了植株内NO_2~-积累,抑制了水稻的生长;低温胁迫下NR活性降低,NO_2~-积累量减少,S_(532)定向突变转基因株系保持了较高的NH_4~+和游离氨基酸的含量,增强了对低温胁迫的耐受性。(本文来源于《2019年中国作物学会学术年会论文摘要集》期刊2019-10-27）
肖洪喜,李倩,常秀丽,张玉彬,周志俊[2]（2019）在《磷酸化Akt1(Ser473)位点谷氨酸突变BV-2细胞系的建立》一文中研究指出目的蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其磷酸化形态调控细胞代谢、增殖、凋亡、周期等生物学过程。Akt1是Akt的一种亚型,其缺乏引起小胶质细胞(BV-2)的M1型活化。为探究磷酸化Akt1在BV-2细胞活化过程中的作用,建立磷酸化Akt1(Ser473)位点谷氨酸突变的过表达BV-2细胞系。方法采用基因位点突变,建立p CDH-Akt1(S473E)质粒,并进行慢病毒包装,构造LV-pCDH-Akt1(S473E)慢病毒。采用CCK8法确定嘌呤霉素最佳筛选浓度,在96孔板中培养细胞(每孔约含1×10^4个),用含不同浓度梯度(2,4,6,8μg·mL~(-1))的不含抗生素的培养基进行培养,每日进行细胞活力检测,选择在3～4天使细胞全部死亡的最低浓度。采用荧光显微镜观察细胞GFP的表达,确定慢病毒的最佳感染复数值(multiplicity of infection,MOI),用不同滴度(10^7,10^6,10^5,10^4,0TU/ml)慢病毒在96孔板中感染细胞,24h后换成完全培养基,以培养72 h后,表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)细胞的比例达到50%～70%为最佳感染滴度。以最佳感染滴度进行细胞转染,72h后用最佳嘌呤霉素浓度进行细胞筛选,通过免疫印迹法(Western Blot)检测Akt1(Ser473)和磷酸化Akt1(Ser473)的蛋白含量,以确定过表达细胞的成功建立。结果嘌呤霉素浓度为6和8μg·mL~(-1)时,细胞在第一天即全部杀死;浓度为4μg·mL~(-1)时,细胞在第叁天时被全部杀死;浓度为2μg·mL~(-1)时,细胞在第四天被全部杀死,因此,选择2μg·mL~(-1)嘌呤霉素作为筛选转染细胞的最佳浓度。荧光显微镜观S察可见,细胞在转染过程中形态呈梭形,有触角,与未转染组形态一致。在病毒感染24 h后,病毒滴度为10^6和10^7TU/ml组可见少量GFP表达,72h后,病毒滴度高于10^5TU/ml组均可见GFP表达,其中,10^7TU/ml组表达量最高,约为70%。免疫印迹法检测细胞Akt1蛋白结果显示,相较于未转染的细胞,转染后的细胞磷酸化Akt1表达显着增加(P<0.05)。结论通过慢病毒转染的方法建立了磷酸化Akt1(Ser473)位点谷氨酸突变的BV-2细胞系,为体外研究Akt1在BV-2活化过程中的作用提供了前提。(本文来源于《中国毒理学会第九次全国毒理学大会论文集》期刊2019-09-17）
郭倪君,车琳,黄婧,吴自力,刘琪[3]（2019）在《GPX4Ser2磷酸化位点调节肝癌细胞诱导性铁死亡的功能学作用研究》一文中研究指出目的铁死亡是一种铁依赖性脂质过氧化诱导的非凋亡性调节性细胞死亡(RCD),可参与肿瘤细胞杀伤作用。研究报道半胱氨酸缺乏诱导的铁死亡依赖于线粒体,铁死亡的核心调节因子谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的N端具有线粒体定位序列,且富马酸盐共价修饰GPX4Cys93可抑制其活性促进铁死亡,提示GPX4功能存在翻译后修饰调控。课题组前期预测和筛查了GPX4存在多个潜在(去)磷酸化位点,但其特定位点磷酸化/去磷酸化修饰的功能尚待研究。本研究拟探讨GPX4中N端丝氨酸2位点(GPX4Ser2)磷酸化状态介导线粒体p53质核分布调节及其在诱导肝癌细胞铁死亡中的作用。方法:利用GEO数据库筛选HCC病例进行肝组织中相关基因表达关联性分析;构建GPX4稳定高表达及GPX4的Ser2、Ser112定点突变模拟高磷酸化(S>D)和去磷酸化(S>A)的人肝癌HepG2和Huh-7细胞定点突变细胞株,给予索拉非尼(Sora,10μmol·L~(-1),24 h)处理建立诱导性肝癌细胞铁死亡模型,Ferrostatin-1(Fer-1,1μmol·L~(-1),24 h)干预建立铁死亡抑制模型进行体外试验;免疫印迹实验(WB)检测GPX4蛋白水平;流式细胞术(FCM)检测C11-BODIPY探针标记的脂质过氧化状态;MTS法检测细胞活力;分离胞浆、线粒体组分,采用线粒体免疫共沉淀法(Mito-IP)检测GPX4与p53相互作用;免疫荧光(IF)激光共聚焦显微镜观察p53在线粒体(Mitotracker)和细胞核(DAPI)的定位分布变化。结果①HCC病例数据库中(GSE76427),与癌旁组织(n=52)相比,肝癌组织(n=115)中铁死亡敏感性负调控因子及肿瘤增殖相关的ECAD基因相对表达水平下调、铁死亡相关的GPX4基因相对表达水平上调,且二者呈负相关(P<0.05);②与对照组相比,Sora处理组诱导性铁死亡HepG2与MHCC97H细胞中GPX4水平及细胞活力均下降(P<0.05)、且Fer-1干预组细胞中GPX4水平及细胞活力均升高(P<0.05),但各组Huh-7细胞中未见差异;③与对照细胞相比,GPX4稳定高表达的HepG2-GPX4细胞在Sora处理组未见脂质过氧化指标的明显改变;④与HepG2-GPX4对照细胞相比,模拟GPX4去磷酸化的HepG2-GPX4-S2A细胞中脂质过氧化水平增加(P<0.05),提示GPX4Ser2去磷酸化参与铁死亡的诱导发生;与模拟GPX4高磷酸化的HepG2-GPX4-S2D细胞相比,Sora处理组HepG2-GPX4-S2A细胞中Mito-IP可见GPX4与p53在线粒体上互作减少,IF实验可见p53(绿色)和细胞核(蓝色)的共定位(青色荧光点)增加、p53(绿色)和线粒体(红色)共定位(黄色荧光点)减少,细胞活力下降(P<0.05)、且Fer-1干预组细胞活力升高(P<0.05),提示p53由线粒体逆行转位至细胞核与诱导性铁死亡有关。⑤与Huh-7-GPX4-S2D细胞相比,Sora处理组Huh-7-GPX4-S2A细胞中脂质过氧化水平增加、细胞活力下降(P<0.05)。结论 GPX4Ser2去磷酸化可经由其线粒体分布调控线粒体p53逆行入核信号参与诱导性铁死亡的调节;结果为筛查GPX4功能性(去)磷酸化修饰位点及阐明其蛋白磷酸酶(如PP2A)调控在肝致癌作用中的分子机制和靶向干预介导肝癌细胞铁死亡依赖性肿瘤化学预防提供实验依据。(本文来源于《中国毒理学会第九次全国毒理学大会论文集》期刊2019-09-17）
张博涵,董道松,郭欣欣,陶学恕,赵梦楠[4]（2019）在《神经型一氧化氮合酶不同位点磷酸化在大鼠神经病理性疼痛中的作用机制》一文中研究指出目的研究神经型一氧化氮合酶(nNOS)不同位点的磷酸化,在大鼠神经病理性疼痛过程中对疼痛的调节作用。方法选取56只SD大鼠建立坐骨神经分支损伤(SNI)模型,通过von Frey纤毛测量后足疼痛缩足阈值代表大鼠机械痛阈,观察疼痛程度。同时收集腰段脊髓组织,检测其中nNOS Ser~(847)及Ser~(1417)位点磷酸化的表达量,并在鞘内注射相应蛋白激酶的抑制剂,观察磷酸化表达量的变化。结果建立SNI模型后,大鼠机械痛阈值降低(P<0.05)。在疼痛产生过程中,nNOS Ser~(847)及Ser~(1417)位点都发生磷酸化,但表达量最高时间点不同。在鞘内分别给予KN-93及Wortmannin后,与之相应的nNOS Ser~(847)和Ser~(1417)磷酸化明显减少(P<0.05)。结论在大鼠神经病理性疼痛模型中,nNOS Ser~(847)及Ser~(1417)分别被CaMKⅡ、PKB/Akt磷酸化,导致一氧化氮合成量改变,对神经病理性疼痛起到不同的调节作用。(本文来源于《中国医科大学学报》期刊2019年07期）
孙晓宇,王玉,李竹,夏冰,戴佳琳[5]（2019）在《缝隙连接蛋白43及其S368位点磷酸化水平与甲基苯丙胺诱导的心肌毒性的关系》一文中研究指出目的通过构建SD大鼠的甲基苯丙胺(METH)中毒模型与心肌细胞中毒模型,检测缝隙连接蛋白43(Cx43)及其S368位点磷酸化(p-Cx43)表达水平;检测吸食METH的人心肌组织内Cx43及其S368位点p-Cx43的表达情况,分析其与METH诱导的心肌毒性的关系,探讨Cx43及S368位点p-Cx43水平在METH诱导的心肌毒性中的作用。方法建立SD大鼠METH慢性中毒动物模型和新生SD大鼠心肌原代METH中毒细胞模型;提取蛋白,采用Western blot检测Cx43、p-Cx43蛋白的表达情况;分析Cx43及其S368位点p-Cx43水平与METH诱导的心肌毒性的关系。收集贵州医科大学法医司法鉴定中心中经毒化检验确认吸食METH的人心肌组织为实验组,无吸食任何毒品者为对照组;常规石蜡切片,HE染色观察2组心肌的结构改变;免疫组织化学染色法、Western blot检测Cx43及其S368位点p-Cx43的表达水平。结果 (1)在METH慢性中毒动物模型中Cx43及S368位点p-Cx43表达较对照组明显下降(P<0.05);(2)在METH中毒细胞浓度、时间梯度模型中,Cx43及其S368位点p-Cx43表达量较对照组显着下降(P<0.05);(3)与对照组比较,实验组人心肌细胞呈现萎缩、坏死及局灶性出血等病理改变;(4)与对照组相比,实验组人心肌组织中Cx43及S368位点p-Cx43表达水平降低,主要表现为心肌细胞之间闰盘处的棕黄色着色减少,部分呈现侧膜化改变;(5)实验组人心肌组织Cx43及S368位点p-Cx43蛋白表达较对照组下降(P<0.05)。结论 METH能通过减少心肌中Cx43及其S368位点p-Cx43的表达,从而破坏心肌的组织结构,影响心脏的正常功能。(本文来源于《中国动脉硬化杂志》期刊2019年05期）
闫新可[6]（2019）在《在L02和HepG2细胞中鉴定UHRF2磷酸化修饰差异位点以及研究其相关的生物学功能》一文中研究指出目的本文在肝癌细胞(HepG2)和正常肝细胞(L02)中鉴定UHRF2的磷酸化修饰差异位点,并探究UHRF2的磷酸化修饰差异位点对其生物学功能的影响。方法本文通过LC-MS-MS技术定量分析UHRF2蛋白在HepG2和L02细胞中的磷酸化修饰差异位点;蛋白免疫印迹技术(WB)检测UHRF2磷酸化位点突变体以及TIP60相关蛋白的表达;流式细胞技术(FCM)检测UHRF2磷酸化位点对细胞周期的影响;免疫荧光技术(IF)验证UHRF2磷酸化位点突变体蛋白的细胞定位;体内泛素化实验检测UHRF2磷酸化位点对其泛素化能力的影响。结果LC-MS-MS结果显示,在HepG2细胞和L02细胞中,UHRF2第643位丝氨酸(S643)和第683位丝氨酸(S683)中的磷酸化修饰水平具有差异;构建UHRF2磷酸化位点突变质粒,并进行DNA测序检测突变质粒的序列;WB检测UHRF2磷酸化位点突变体能够在HepG2细胞和L02细胞中正常表达;FCM检测到在L02细胞中,与WT UHRF2组相比,突变体组中S期细胞显着减少,而G1和G2期的细胞数量显着增加。在HepG2细胞中,与WT UHRF2组相比,UHRF2 S643A和UHRF2 S643A/S683A组中S期细胞显着减少,而UHRF2 S643A/S683A组在G1期和G2期的细胞显着增加;IF实验证明UHRF2的磷酸化位点突变不影响UHRF2在细胞中的亚定位;WB实验检测到UHRF2磷酸化位点突变影响H3K9和H3K14的乙酰化修饰水平;体内泛素化实验检测到UHRF2的磷酸化位点影响自身的泛素化能力。结论在正常肝细胞(L02)和肝癌细胞(HepG2)中,UHRF2存在磷酸化修饰差异位点,UHRF2磷酸化位点不影响其自身的亚定位,但对其泛素化能力,细胞周期,TIP60相关蛋白的表达方面产生影响。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2019-05-01）
彭叁飞[7]（2019）在《Fyn在Y272位点磷酸化TOPK促进胃癌的增殖》一文中研究指出研究背景与目的:胃癌的强异质性导致目前可应用于临床诊治的分子靶点甚少,寻找新型有效的靶点可望进一步提高胃癌疗效。蛋白磷酸化修饰是肿瘤病理进程中的重要事件,而蛋白激酶是蛋白磷酸化发生的必要组成部分。Fyn是属于SRC家族的非受体酪氨酸蛋白激酶,其广泛参与多种肿瘤的发生发展,然而在胃癌中的致病机制未知。TOPK是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,已有研究表明TOPK在多种肿瘤中蛋白表达水平及活性升高,进而促进肿瘤的发生发展,其中包括胃癌。SRC作为TOPK上游分子磷酸化TOPK导致结肠癌的发生已经得到相关研究证实。结合我们前期研究发现Fyn和TOPK在胃癌组织及细胞中均高表达,而Fyn和SRC同属一个蛋白激酶家族,因此我们推测Fyn是否可直接结合并激活TOPK。为了证实我们的推测,接下来我们探究Fyn与TOPK在胃癌临床样本中表达的相关性以及Fyn是否磷酸化TOPK和磷酸化位点,明确Fyn在胃癌发生发展中的角色及其中潜在的机制。研究对象和方法:1、检测Fyn和TOPK蛋白在多种胃癌细胞株和正常胃粘膜上皮细胞中表达水平差异。2、在下调Fyn表达后,采用MTT实验和软琼脂克隆形成实验(soft agar)检测沉默Fyn对胃癌细胞增殖的影响。3、通过磷32标记的同位素实验验证Fyn是否直接磷酸化TOPK。在确认Fyn磷酸胡TOPK后,利用NetPhos3.1软件预测TOPK最有可能被Fyn磷酸化的酪氨酸位点。根据预测的酪氨酸位点合成相应肽段,同位素实验确认Fyn磷酸化TOPK位点。合成上一步确认的磷酸化位点的磷酸化抗体(p-TOPK(Y74)、p-TOPK(Y272),然后构建TOPKY74、Y272单突变和Y74Y272双突变原核表达质粒,并表达蛋白,通过体外激酶实验验证Fyn主要在Y272磷酸化TOPK。4、通过蛋白质体外结合实验(pull-down)和免疫共沉淀(CO-IP)实验在细胞水平证实Fyn可直接结合TOPK。5、通过蛋白质印迹法(Western Blot)检测沉默Fyn表达后对TOPK磷酸化水平的影响及TOPK下游信号通路分子的变化。6、利用免疫组化实验检测Fyn、非磷酸化和磷酸化TOPK蛋白在胃癌患者组织中的表达水平。制备TOPK(P-Y272)抗体;胃癌临床标本96例。7、分析Fyn和TOPK在胃癌和癌旁组织的间的表达差异,并利用癌症数据库分析Fyn和TOPK与患者总体生存期(OS)之间的关系。研究结果:1、Fyn在胃癌组织和胃癌细胞中高表达且是导致胃癌患者预后不良的分子靶标。2、Fyn与TOPK表达水平成正相关及导致胃癌患者预后差。3、沉默Fyn表达可抑制胃癌细胞的增殖及克隆形成能力。4、体内外实验证实Fyn可与TOPK直接结合。5、体外激酶实验证实Fyn可在Y272位点磷酸化TOPK。6、Fyn磷酸化TOPK通过激活下游ERK信号通路促进胃癌的增殖。结论:1、Fyn蛋白过表达预示胃癌患者预后差相关。2、Fyn在Y272位点磷酸化TOPK。3、Fyn与TOPK在胃癌组织的表达成强正相关。(本文来源于《郑州大学》期刊2019-05-01）
林宇斌[8]（2019）在《Cortactin不同磷酸化位点在模拟气道剪应力作用下对气道黏液分泌的影响》一文中研究指出目的:探究在模拟最适气道剪应力的作用下Cortactin不同关键磷酸化位点对MUC5AC分泌的影响。方法:(1)构建野生型CTTN的PTSB质粒,通过对CTTN基因(Cortactin gene,皮层肌动蛋白基因)主要关键酪磷酸化位点(Y421、Y470、Y486)进行定点突变,将原来酪氨酸残基替换为成丙氨酸(A),模拟相关位点非磷酸化状态。构建重组质粒PTSB02-GFP-CTTN-Y421A、PTSB02-GFP-CTTN-Y470A、PTSB02-GFP-CTTN-Y486A、PTSB02-GFP-CTTN,酶切鉴定并测序。(2)剪应力模拟装置参考Tarran等的实验研究,采用相位运动仪器,通过不断加速/减速交替进行的方式模拟人体呼吸过程中呼气与吸气的交替对气道上皮的剪应力作用。通过对调节加速/减速的时间和频率模拟病理状态下增大的剪应力和呼吸频率。为模拟病理状态下气流对气道上皮细胞的剪应力作用,本实验把加速/减速的参数设置为1.2 s/次,30次/min,作用35 min。(3)人支气管上皮细胞(16HBE)置于37℃、5%CO_2培养箱中培养,取状态好的细胞以5×10~5个细胞/孔种于6孔板中,置于37℃、5%CO_2培养箱中培养,待16HBE细胞生长至汇合度达70%左右时,随机分成6组:组(A)Y421A、组(B)Y470A、组(C)Y486A、组(D)野生型CTTN、组(E)空白质粒阴性对照、组(F)空白对照。使用lipo3000试剂转染16HBE细胞。孵育24 h后施予剪应力刺激,放回培养箱中继续孵育24 h后分析转染细胞,进行相关实验检测。(4)采用蛋白质免疫印迹(Western blotting,WB)检测Cortactin、p-Cortactin Y421、p-Cortactin Y470、p-Cortactin Y486蛋白相对表达水平;采用RT-PCR检测其Cortactin基因mRNA相对表达水平,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞外MUC5AC的相对分泌量。结果:(1)经基因测序及酶切鉴定,CTTN基因主要磷酸化位点(Y421、Y470、Y486)定点突变成功,成功构建重组质粒(PTSB02-GFP-CTTN-Y421A、PTSB02-GFP-CTTN-Y470A、PTSB02-GFP-CTTNY486A、PTSB02-GFP-CTTN),可用于后续实验。(2)通过Lipo3000试剂转染,荧光显微镜观察提示质粒转染成功,转染效率均达80%以上。(3)荧光定量PCR检测各组细胞中Cortactin基因mRNA的表达水平:与阴性对照及空白对照比较,各组质粒转染组细胞中Cortactin mRNA表达水平明显升高;各质粒转染组之间相比,各组表达Cortactin mRNA表达水平基本相同。(4)ELISA测定各组细胞MUC5AC胞外分泌量:A组中MUC5AC胞外分泌水平显着低于B组、C组、D组,差异均有统计学意义(P<0.01),B组MUC5AC胞外分泌水平低于D组,差异均有统计学意义(P<0.05),A组MUC5AC胞外分泌水平显着高于E组、F组,差异有统计学意义(P<0.05),C组与D组,差异无统计学意义(P>0.05),E组与F组,差异无统计学意义(P>0.05)。(5)Western Blotting检测各组细胞中Cortactin蛋白及p-Cortactin Y421、p-Cortactin Y470、p-Cortactin Y486蛋白相对水平:与E、F组比较,A、B、C、D组Cortactin蛋白表达水平明显增高,各质粒转染组之间比较,Cortactin相对表达水平基本相同;与B、C、D组比较,A组p-Cortactin Y421蛋白相对表达显着降低;各组细胞中p-CortactinY470及p-CortactinY486的相对含量与胞外MUC5AC分泌无明显相关性。结论:模拟气道剪应力作用下Cortactin磷酸化位点Y421的磷酸化促进MUC5AC的分泌作用最强;Y470的磷酸化对MUC5AC的分泌有一定促进作用;Y486的磷酸化对MUC5AC的分泌几乎无作用。(本文来源于《遵义医科大学》期刊2019-05-01）
翁峰标,朱立帆,杨立文,李勇,刘荣[9]（2019）在《B淋巴细胞瘤-2蛋白多位点磷酸化在大鼠脊髓损伤后细胞自噬中的表达研究》一文中研究指出目的探讨大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后细胞自噬的变化及其与B淋巴细胞瘤-2(Bcell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白多位点磷酸化的关系。方法取40只8周龄雄性SD大鼠,采用改良Allen法制备SCI模型;将造模成功的36只大鼠随机分为SCI组、自噬抑制剂组、自噬促进剂组,每组12只。另取12只大鼠仅切除椎板、不损伤脊髓,作为假手术组。造模结束后,自噬抑制剂组及自噬促进剂组分别于脊髓鞘内注射20μL600 nmol/L 3-甲基腺嘌呤、25 nmol/L雷帕霉素,假手术组及SCI组仅注射20μL生理盐水;每天1次,连续4周。造模后1 d及1、2、4周,采用BBB评分法评价各组大鼠后肢运动功能。末次注射后24 h处死各组大鼠并取脊髓组织,ELISA法检测脊髓组织中过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性及TNF-α、IL-1β水平;HE染色观察脊髓组织形态学变化;透射电镜观察脊髓组织中线粒体超微结构变化;免疫荧光染色检测自噬相关蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)蛋白表达;TUNEL染色观察脊髓组织神经细胞凋亡;免疫荧光双染检测LC3/TUNEL阳性细胞表达;Western blot检测细胞Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、Bcl-2及p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达。结果与假手术组相比,SCI组各时间点BBB评分降低,MPO活性、TNF-α、IL-1β水平升高;神经细胞周围间隙增大,细胞肿胀、出现空泡,线粒体中出现自噬小体;Beclin1及LC3蛋白阳性率、神经细胞凋亡率显着升高;LC3、TUNEL阳性细胞增多;Bax、p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低;以上指标比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与SCI组相比,自噬抑制剂组各时间点BBB评分降低,MPO活性、TNF-α、IL-1β水平升高;线粒体中出现少量自噬囊泡;Beclin1及LC3蛋白阳性率降低,神经细胞凋亡率显着升高;LC3阳性细胞减少、TUNEL阳性细胞增多;Bax、p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低。而自噬促进剂组结果与自噬抑制剂组相反;以上指标组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论大鼠SCI后通过诱导细胞自噬可降低神经细胞凋亡,保护脊髓功能,其机制可能与抑制Bcl-2蛋白多位点磷酸化有关。(本文来源于《中国修复重建外科杂志》期刊2019年05期）
陶相明[10]（2019）在《丹酚酸B调控Smad2/3不同位点磷酸化及Nrf-2/HO-1信号通路抗肝损伤》一文中研究指出肝脏是机体代谢的主要场所,其作用主要有维持氧化还原平衡、调节血糖以及蛋白质合成等。肝脏在物理或者化学刺激时,肝脏氧化还原失调,可导致自由基在组织中积累造成肝脏急性损伤。而肝纤维化是在各种肝损伤的情况下发生的持续性病理性损伤-修复过程,肝纤维化可进一步发展为肝硬化乃至肝癌,严重威胁人类健康。深入研究肝脏急性损伤到肝纤维化的发生发展,在细胞和分子水平探讨肝损伤到肝纤维化机理,从而针对相应的信号靶点来设计特定的治疗药物,达到延缓或阻断肝急慢性损伤的目的。在常见肝损伤中药物引起肝损伤最为严重。肝损伤常常伴随炎症的发生,其机制是产生亲电子产物、自由基等,造成脂质过氧化。而肝纤维化的特点是细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡,大量积累。TGF-β_1被认为是HSC最有效的活化因子,通过TGF-β/Smad信号通路发挥促纤维化作用,目前研究显示在TGF-β/Smad信号通路中pSmad2C和pSmad2L传递促纤维化和促迁移信号,pSmad3C传递的细胞生长抑制信号,pSmad3L传递细胞侵袭和ECM积累信号。丹酚酸B(Sal B)为丹参的根及根茎提取而得,具有抗氧化作用和抗纤维化作用~([1]),前期研究发现Sal B可通过调节氧化应激和TGF-β/Smad信号通路发挥作用。但是在此过程中Sal B如何调节pSmad2和pSmad3不同位点磷酸化尚不清楚,而且Sal B抗氧化作用是否影响Nrf2/HO-1通路也未见报道。本研究用CCl_4诱导小鼠急性肝损伤、肝纤维化,用H_20_2诱导HSC-T6氧化损伤,并用Sal B干预。观察Sal B抗急性肝损伤和肝纤维化作用及其分子机制研究,尤其是在pSmad2和pSmad3不同位点磷酸化的调节和Nrf2/HO-1通路方面进行探讨。目的:1、目前研究显示Sal B具有抗急性损伤和抗肝纤维化作用,能改善肝功能,在此基础上本实验通过病理染色和胶原纤维染色进行分析、评价Sal B对CCl_4致小鼠急性肝损伤和肝纤维化组织病理学改变的影响。2、通过检测肝功能指标和组织氧化应激指标,分析Sal B在CCl_4致小鼠急性肝损伤和肝纤维化中的抗氧化作用。3、观察在CCl_4诱导的小鼠急性肝损伤、肝纤维化模型及Sal B干预下,pSmad2C、pSmad2L、pSmad3C、pSmad3L以及Nrf-2/HO-1水平变化。分析Sal B抗CCl_4诱导的急性肝损伤、肝纤维化作用与不同位点pSmad2,pSmad3信号转导以及Nrf-2/HO-1信号通路之间的关系。4、观察Sal B对H_2O_2诱导的HSC-T6细胞损伤中Smad2磷酸化蛋白(pSmad2C、pSmad2L)以及Nrf-2/HO-1蛋白水平的影响,分析Sal B对pSmad2C、pSmad2L调控作用及Nrf-2/HO-1在此过程中的作用。方法:1、在体内实验中分析丹酚酸B抗CCl_4诱导的急性肝损伤和肝纤维化作用及与Nrf2/HO-1以及TGF-β/Smad通路的关联机制急性肝损伤:6-8周龄小鼠分为正常组、模型组和Sal B组(7.5、15、30 mg/kg)及阳性药物组(秋水仙碱0.1 mg/kg),模型组、Sal B组及秋水仙碱组小鼠腹腔注射(ip)CCl_4(0.1%CCl_4 10 mg/kg/次,每周2次),正常组给与等量的溶媒(橄榄油);Sal B组及秋水仙碱组每日灌胃给与相应剂量药物,正常组和模型组平行给予溶媒(生理盐水)1周后处死。慢性肝损伤(肝纤维化):6-8周龄小鼠分为正常组、模型组和Sal B组(7.5、15、30 mg/kg)及阳性药物组(秋水仙碱0.1 mg/kg),模型组、Sal B组及秋水仙碱组小鼠腹腔注射(ip)CCl_4(20%CCl_4 1 mg/kg/次,每周2次),正常组给与等量的溶媒(橄榄油);Sal B组及秋水仙碱组每日灌胃给与相应剂量药物,正常组和模型组平行给予溶媒(生理盐水)8周后处死。检测小鼠血清中的ALT和AST水平。取出肝脏用多聚甲醛固定并用石蜡包埋,用苏木精和伊红(HE)染色察看肝脏的病理学转变,VG染色观察各组肝纤维化程度。小鼠肝组织中氧化应激指标用超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)试剂盒检测。采用免疫组化染色检测pSmad2C、pSmad2L及Nrf-2分布情况,用免疫印迹试验检测pSmad2C、pSmad2L、pSmad3C、pSmad3L、Nrf-2、HO-1水平变化情况。2、体外细胞实验中观察丹酚酸B对H_2O_2诱导的HSC-T6细胞损伤中Smad2磷酸化蛋白(pSmad2C、pSmad2L)以及Nrf-2/HO-1水平的影响。体外常规培养HSC-T6细胞至对数生长期。实验分为对照组、H_2O_2组以及Sal B(25,50,100 mmol/L)叁个剂量组,于培养结束前24h更换无血清培养基,Sal B组加入相应剂量药物;12h后,H_2O_2组、Sal B干预组加入100μM H_2O_2,对照组加入等体积溶媒。待6h后,各组加入细胞裂解液,并用细胞刮充分收集细胞,然后提取总蛋白,免疫印迹试验检测样本中pSmad2C、pSmad2L、Nrf-2、HO-1蛋白表达水平结果:1 Sal B缓解CCl_4诱导的小鼠急性肝损伤和肝纤维化病理进程,并干扰pSmad2L/C,pSmad3L/C信号转导,增强Nrf-2/HO-1信号1.1 Sal B缓解CCl_4诱导的小鼠急性肝损伤和肝纤维化病理改变急性肝损伤阶段:HE染色后可观察到正常组小鼠肝脏组织中细胞核被深染显蓝色,细胞质被染红色,细胞向汇管区有序排列,未见细胞坏死。在CCl_4刺激后肝组织可见炎细胞浸润和细胞病变。而丹酚酸B各剂量组炎细胞浸润减少,细胞病变情况改善。肝纤维化阶段:HE染色后可观察到正常组小鼠肝脏组织细胞向汇管区有序排列,未见细胞坏死,VG染色未见胶原纤维。在CCl_4刺激后,模型组肝组织可见纤维化病变和细胞坏死,结合VG染色可见汇管区出现严重纤维化。与模型组比较丹酚酸B各剂量组呈浓度依赖性地减少胶原纤维增生。1.2 Sal B改善CCl_4诱导的小鼠急性肝损伤和肝纤维化血清ALT、AST急性肝损伤阶段:结果显示CCl_4刺激后模型组ALT、AST水平显着升高;丹酚酸B中、高剂量组ALT、AST水平均显着降低。肝纤维化阶段:结果显示CCl_4刺激后模型组血清ALT、AST水平显着升高;丹酚酸B中、高剂量组ALT、AST水平显着降低。1.3 Sal B改善CCl_4诱导的小鼠急性肝损伤和肝纤维化组织氧化应激指标急性肝损伤阶段:CCl_4刺激后小鼠肝组织中SOD活力显着降低,而丹酚酸B高剂量组明显升高(改善);CCl_4刺激后小鼠肝组织中GSH水平显着降低,丹酚酸B中、高剂量组明显升高;CCl_4刺激后MDA水平明显升高,而丹酚酸B中、高剂量组均明显减少。肝纤维化阶段:CCl_4刺激后小鼠肝组织中SOD活力显着降低,而丹酚酸B中、高剂量组明显升高(改善);CCl_4刺激后小鼠肝组织中GSH水平显着降低,丹酚酸B中、高剂量组明显升高;CCl_4刺激后MDA水平明显升高,而丹酚酸B低、中、高剂量组均明显减少。1.4 Sal B调控CCl_4诱导的小鼠急性肝损伤和肝纤维化组织中pSmad2C、pSmad2L、pSmad3C、pSmad3L表达在CCl_4诱导的小鼠急性肝损伤实验以及肝纤维化模型中,pSmad2C、pSmad2L、pSmad3L蛋白水平显着上调,而丹酚酸B呈浓度依赖性地抑制其上调。CCl_4刺激后pSmad3C无显着性改变,而丹酚酸B呈浓度依赖性地增强其表达。1.5 Sal B上调CCl_4诱导的小鼠急性肝损伤和肝纤维化组织中Nrf2、HO-1的表达在CCl_4诱导的小鼠急性肝损伤实验中,Nrf2和HO-1蛋白水平上调但无显着性,而丹酚酸B呈浓度依赖性增强Nrf2和HO-1蛋白表达,免疫组化检测显示,在肝组织中Nrf2表达较少,而丹酚酸B呈浓度依赖性地增强Nrf2蛋白表达。而在CCl_4诱导的小鼠肝纤维化实验中,Nrf2和HO-1蛋白水平显着性上调,而丹酚酸B各组Nrf2蛋白表达较模型组下调,免疫组化检测显示,CCl_4诱导小鼠肝纤维化后肝组织中Nrf2表达显着增加,且Nrf2多见于汇管区纤维化周围,而在丹酚酸B各组中,因纤维化的减少肝汇管区周围Nrf2的表达区域缩小。2 Sal B对H_2O_2诱导的HSC-T6细胞损伤中Smad2磷酸化蛋白(pSmad2C、pSmad2L)以及Nrf-2/HO-1水平的影响2.1 Sal B下调H_2O_2诱导的HSC-T6细胞损伤中pSmad2C、pSmad2L在H_2O_2刺激下,HSC-T6细胞pSmad2C、pSmad2L蛋白表达增加,而Sal B各剂量组,可呈浓度依赖性的抑制H_2O_2刺激引起的pSmad2C、pSmad2L上调。2.2 Sal B上调H_2O_2诱导的HSC-T6细胞损伤中Nrf-2、HO-1在H_2O_2刺激下,HSC-T6细胞中,Nrf-2、HO-1蛋白表达变化不明显,而Sal B预处理组中丹酚酸B呈浓度依赖性的增强Nrf2和HO-1蛋白表达。结论:1.Sal B具有抗CCl_4诱导的小鼠急性肝损伤和肝纤维化作用2.Sal B通过抑制pSmad2C、pSmad2L,pSmad3L和促进pSmad3C表达发挥作用。提示Sal B抗急性肝损伤和肝纤维化作用与Smad2和Smad3的C末端和连接区磷酸化有关;Sal B增强Nrf2和HO-1蛋白表达,提示Sal B增强Nrf-2/HO-1信号发挥抗氧化损伤作用。(本文来源于《安徽医科大学》期刊2019-02-01）
磷酸化位点论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其磷酸化形态调控细胞代谢、增殖、凋亡、周期等生物学过程。Akt1是Akt的一种亚型,其缺乏引起小胶质细胞(BV-2)的M1型活化。为探究磷酸化Akt1在BV-2细胞活化过程中的作用,建立磷酸化Akt1(Ser473)位点谷氨酸突变的过表达BV-2细胞系。方法采用基因位点突变,建立p CDH-Akt1(S473E)质粒,并进行慢病毒包装,构造LV-pCDH-Akt1(S473E)慢病毒。采用CCK8法确定嘌呤霉素最佳筛选浓度,在96孔板中培养细胞(每孔约含1×10^4个),用含不同浓度梯度(2,4,6,8μg·mL~(-1))的不含抗生素的培养基进行培养,每日进行细胞活力检测,选择在3～4天使细胞全部死亡的最低浓度。采用荧光显微镜观察细胞GFP的表达,确定慢病毒的最佳感染复数值(multiplicity of infection,MOI),用不同滴度(10^7,10^6,10^5,10^4,0TU/ml)慢病毒在96孔板中感染细胞,24h后换成完全培养基,以培养72 h后,表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)细胞的比例达到50%～70%为最佳感染滴度。以最佳感染滴度进行细胞转染,72h后用最佳嘌呤霉素浓度进行细胞筛选,通过免疫印迹法(Western Blot)检测Akt1(Ser473)和磷酸化Akt1(Ser473)的蛋白含量,以确定过表达细胞的成功建立。结果嘌呤霉素浓度为6和8μg·mL~(-1)时,细胞在第一天即全部杀死;浓度为4μg·mL~(-1)时,细胞在第叁天时被全部杀死;浓度为2μg·mL~(-1)时,细胞在第四天被全部杀死,因此,选择2μg·mL~(-1)嘌呤霉素作为筛选转染细胞的最佳浓度。荧光显微镜观S察可见,细胞在转染过程中形态呈梭形,有触角,与未转染组形态一致。在病毒感染24 h后,病毒滴度为10^6和10^7TU/ml组可见少量GFP表达,72h后,病毒滴度高于10^5TU/ml组均可见GFP表达,其中,10^7TU/ml组表达量最高,约为70%。免疫印迹法检测细胞Akt1蛋白结果显示,相较于未转染的细胞,转染后的细胞磷酸化Akt1表达显着增加(P<0.05)。结论通过慢病毒转染的方法建立了磷酸化Akt1(Ser473)位点谷氨酸突变的BV-2细胞系,为体外研究Akt1在BV-2活化过程中的作用提供了前提。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
磷酸化位点论文参考文献
[1].韩瑞才,徐志荣,何汛锋,石庆华,吴自明.硝酸还原酶磷酸化位点S_(532)定向突变增强水稻幼苗的耐冷性[C].2019年中国作物学会学术年会论文摘要集.2019
[2].肖洪喜,李倩,常秀丽,张玉彬,周志俊.磷酸化Akt1(Ser473)位点谷氨酸突变BV-2细胞系的建立[C].中国毒理学会第九次全国毒理学大会论文集.2019
[3].郭倪君,车琳,黄婧,吴自力,刘琪.GPX4Ser2磷酸化位点调节肝癌细胞诱导性铁死亡的功能学作用研究[C].中国毒理学会第九次全国毒理学大会论文集.2019
[4].张博涵,董道松,郭欣欣,陶学恕,赵梦楠.神经型一氧化氮合酶不同位点磷酸化在大鼠神经病理性疼痛中的作用机制[J].中国医科大学学报.2019
[5].孙晓宇,王玉,李竹,夏冰,戴佳琳.缝隙连接蛋白43及其S368位点磷酸化水平与甲基苯丙胺诱导的心肌毒性的关系[J].中国动脉硬化杂志.2019
[6].闫新可.在L02和HepG2细胞中鉴定UHRF2磷酸化修饰差异位点以及研究其相关的生物学功能[D].重庆医科大学.2019
[7].彭叁飞.Fyn在Y272位点磷酸化TOPK促进胃癌的增殖[D].郑州大学.2019
[8].林宇斌.Cortactin不同磷酸化位点在模拟气道剪应力作用下对气道黏液分泌的影响[D].遵义医科大学.2019
[9].翁峰标,朱立帆,杨立文,李勇,刘荣.B淋巴细胞瘤-2蛋白多位点磷酸化在大鼠脊髓损伤后细胞自噬中的表达研究[J].中国修复重建外科杂志.2019
[10].陶相明.丹酚酸B调控Smad2/3不同位点磷酸化及Nrf-2/HO-1信号通路抗肝损伤[D].安徽医科大学.2019
论文知识图
