论文摘要
脂肪酶作为重要的工业酶制剂之一,以其独特的催化特性广泛应用在工业生产中。然而,工业生产往往伴随高温条件,天然脂肪酶的热稳定性难以满足应用要求,导致生产损失率高、生产成本增加。针对这种现状,本研究利用基因融合手段、定点突变技术并结合结构晶体分析对脂肪酶的热稳定性进行改造,主要包括:1.利用基因融合手段对两种脂肪酶进行热稳定性改造,包括来源于华根霉的热稳定性较差的脂肪酶r27RCL和难以满足工业生产要求的来源于嗜热丝孢菌的脂肪酶TLL。本研究利用刚性接头（Linker1,L1）和柔性接头（Linker2,L2）将具有疏水性的自组装双亲短肽SAP（AEAEAKAKAEAEAKAK）分别与两种脂肪酶N端融合以提高蛋白质表面的疏水性,从而增强蛋白质的稳定程度。通过实验获得了四株热稳定性提高的融合脂肪酶（SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL）。对脂肪酶r27RCL、SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL在60℃下进行热稳定性实验,结果表明:融合蛋白SAP-L1-r27RCL和SAP-L2-r27RCL的半衰期较野生型分别提高1.75倍和1.20倍。对脂肪酶TLL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL在80℃下进行热稳定性实验,发现融合蛋白SAP-L1-TLL和SAP-L2-TLL半衰期较野生型分别提高1.50倍和1.17倍。此外,催化反应动力学结果表明四种融合脂肪酶的底物亲和性和催化效率较野生型均有明显提高。综上,对脂肪酶N端进行SAP短肽融合改造可以提高其热稳定性,且刚性接头较柔性接头效果更佳。2.提取脂肪酶r27RCL晶体结构中所有氨基酸的温度因子（B-factor）,并进行归一化处理,发现氨基酸序列（63-TKWDCK-68）的B-factor较大,说明该区域极不稳定。下载自NCBI数据库中所有耐热性/嗜热真菌脂肪酶（共92条）,并进行多序列比对,统计发现耐热/嗜热真菌脂肪酶在此区域的保守序列为63-TNITCT-68。比较两段序列,设计突变位点K64N、W65I、D66T、K68T,并进行定点突变和异源表达,最终获得两株热稳定性提高得突变脂肪酶（r27RCL-K64N、r27RCL-K68T）。在50℃条件下对野生型和突变型脂肪酶耐受120 min,结果表明:r27RCL-K64N和r27RCL-K68T相对剩余酶活较野生型分别提高37.88%和48.20%;在60℃条件下对野生型和突变型脂肪酶耐受90 min,r27RCL-K64N与r27RCL-K68T的半衰期较野生型分别提高了2.4倍和3.0倍;而突变体r27RCL-W65I和r27RCL-D66T的热稳定性较野生型下降。此外,突变脂肪酶的底物亲和性和催化效率较野生型均有明显提高。通过对突变体进行结构模建探索突变体耐热性改变的原因:突变位点K64N和K68T仍保持了野生型脂肪酶该位点与周围氨基酸的氢键相互作用,而突变氨基酸（N64和T68）具有相比于野生型氨基酸更短的侧链,使得该位点的浮动减小、稳定性增强;当将W65突变为I65后,该位点与周围氨基酸的氢键相互作用消失,致使其稳定性下降。3.通过对脂肪酶r27RCL进行三维结构研究发现该脂肪酶含有一个未成对的半胱氨酸C204。利用在线软件Disulfide by Design 2.0预测结构中能够形成二硫键的成对氨基酸,结果表明若将距C204 3.8?的T201突变为C201,C201和C204能够形成二硫键。实验以r27RCL基因为野生型,经定点突变、异源表达获得一株热稳定性明显提高的突变脂肪酶r27RCL-T201C。分别在50℃和60℃条件下对野生型和突变型脂肪酶进行耐受,r27RCL-T201C的半衰期较野生型分别提高了1.25和1.50倍。此外,r27RCL-T201C的底物亲和性和催化效率较野生型有明显提升。然而,突变体r27RCL-T201C的最适温度相比于野生型下降5℃。结构模建发现突变位点T201C靠近影响脂肪酶最适温度的酪氨酸残基（Y200）,新增二硫键局部结构域的稳定性的影响可能导致Y200的不稳定性增强,导致突变脂肪酶r27RCL-T201C最适温度降低。
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摘要Abstract术语及符号说明第1章 绪论 1.1 立题依据 1.2 脂肪酶概况 1.2.1 根霉脂肪酶 1.2.2 疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶 1.2.3 脂肪酶的催化机制 1.2.4 脂肪酶对底物的特性 1.2.4.1 脂肪酸特异性 1.2.4.2 位置特异性 1.2.4.3 立体特异性 1.2.5 脂肪酶热稳定性改造的研究进展 1.2.5.1 理性设计改造脂肪酶的热稳定性 1.2.5.2 定向进化改造脂肪酶的热稳定性 1.2.6 脂肪酶在生活和工业上的应用 1.2.6.1 脂肪酶在食品添加中的应用 1.2.6.2 脂肪酶在医药、卫生中的应用 1.2.6.3 脂肪酶在纺织业中的应用 1.2.6.4 脂肪酶在制备生物柴油中的应用 1.2.6.5 脂肪酶在皮革中的应用 1.3 毕赤酵母表达系统概况 1.3.1 毕赤酵母表达系统的出现 1.3.2 毕赤酵母表达系统的特点 1.3.3 毕赤酵母表达载体 1.4 研究目的 1.5 研究内容第2章 N端融合自组装双亲短肽提高脂肪酶的热稳定性 2.1 自组装双亲短肽的特性与连接肽的选择 2.1.1 自组装双亲短肽的特性 2.1.2 连接肽Linker的选择 2.2 实验材料 2.2.1 质粒与菌株 2.2.2 主要仪器 2.2.3 主要试剂 2.2.4 常用溶液 2.2.5 常用培养基 2.2.6 基因测序与引物的合成 2.3 实验方法 2.3.1 脂肪酶r27RCL、TLL与短肽SAP-L1、SAP-L2基因的获取 2.3.1.1 扩增引物的设计 2.3.1.2 PCR扩增与PCR产物的纯化 2.3.2 脂肪酶SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL与SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL基因的获取 2.3.2.1 PCR融合引物的设计 2.3.2.2 PCR扩增与PCR融合产物的纯化 2.3.3 脂肪酶SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL与SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL真核表达载体的构建 2.3.3.1 pPIC9K载体质粒的提取、酶切与纯化 2.3.3.2 DNA纯化目的片段与双酶切载体pPIC9K质粒重组 2.3.3.3 大肠杆菌感受态E.coli DH5α的制备 2.3.3.4 转化 2.3.3.5 阳性筛选子的鉴定 2.3.4 重组脂肪酶r27RCL、SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL与TLL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL在毕赤酵母中的高效表达 2.3.4.1 重组质粒的提取和线性化 2.3.4.2 毕赤酵母感受态细胞GS115的制备 2.3.4.3 电转化获得阳性克隆菌株 2.3.4.4 重组脂肪酶r27RCL、SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL与TLL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL的甲醇诱导表达 2.3.5 重组脂肪酶r27RCL、SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL与TLL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL的SDS-PAGE凝胶电泳检测及蛋白含量测定 2.3.6 脂肪酶酶活的测定 2.3.6.1 对硝基苯酚法及酶活单位定义 2.3.6.2 对硝基苯酚法标准曲线的绘制 2.3.6.3 对硝基苯酚法酶活的计算 2.3.7 重组脂肪酶r27RCL、SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL与TLL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL的酶学性质的研究 2.3.7.1 脂肪酶的最适pH、pH稳定性、最适温度和耐热性的测定 2.3.7.2 化学试剂及金属离子脂肪酶活力影响的测定 2.3.7.3 脂肪酶动力学参数的测定 2.4 结果与分析 2.4.1 重组质粒SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL与SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL的构建 2.4.1.1 脂肪酶SAP-Ll-r2 7RCL SAP-L2-r27RCL与SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL基因片段的获取和pPIC9K载体线性化 2.4.1.2 脂肪酶SAP-L1-r2 7RCL、SAP-L2-r27RCL与SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL基因片段与线性化载体pPIC9K的连接及转化 2.4.2 重组脂肪酶r27RCL、SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL、TLL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL在毕赤酵母中的高效表达 2.4.3 重组脂肪酶r27RCL、SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL、TLL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL的纯化、鉴定及定量 2.4.4 重组脂肪酶r27RCL、SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL与TLL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL的酶学性质对比研究 2.4.4.1 脂肪酶r27RCL、SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL、TLL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL活性分析 2.4.4.2 脂肪酶r27RCL、SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL的pH活性和pH稳定性测定 2.4.4.3 脂肪酶r27RCL、SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL的最适温度和热稳定性测定 2.4.4.4 金属离子及化学试剂对脂肪酶r27RCL、SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL活力的影响 2.4.4.5 脂肪酶r27RCL、SAP-L1-r27RCL、SAP-L2-r27RCL的动力学参数 2.4.4.6 脂肪酶TLL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL的pH活性和pH稳定性测定 2.4.4.7 脂肪酶TLL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL的最适温度和热稳定性测定 2.4.4.8 金属离子及化学试剂对脂肪酶TLL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL活力的影响 2.4.4.9 脂肪酶TLL、SAP-L1-TLL、SAP-L2-TLL的动力学参数 2.5 讨论 2.6 本章小结第3章 利用温度因子（B-factor）和保守序列分析提高华根霉脂肪酶的热稳定性 3.1 分析华根霉脂肪酶温度因子（B-factor）并确定突变位点 3.2 实验材料 3.2.1 菌株和质粒 3.2.2 主要试剂 3.2.3 主要仪器 3.2.4 主要培养基 3.2.5 主要溶液 3.2.6 DNA测序与引物合成 3.3 实验方法 3.3.1 脂肪酶r27RCL温度因子（B-factor）的计算 3.3.2 脂肪酶r27RCL-K64N、r27RCL-W65I、r27RCL-D66T、r27RCL-K68T的模建方法 3.3.3 突变体脂肪酶r27RCL-K64N、r27RCL-W65I、r27RCL-D66T、r27RCL-K68T真核表达载体的构建 3.3.3.1 突变引物的设计 3.3.3.2 定点突变的进行 3.3.3.3 转化 3.3.3.4 突变后阳性筛选的鉴定与检测 3.3.4 重组脂肪酶r27RCL-K64N、r27RCL-W65I、r27RCL-D66T、r27RCL-K68T在毕赤酵母中的高效表达 3.3.5 重组脂肪酶r27RCL、r27RCL-K64N、r27RCL-W65I、r27RCL-D66T、r27RCL-K68T凝胶电泳检测及蛋白含量测定 3.3.6 重组脂肪酶r27RCL、r27RCL-K64N、r27RCL-W65I、r27RCL-D66T、r27RCL-K68T酶活测定方法 3.3.7 重组脂肪酶r27RCL、r27RCL-K64N、r27RCL-W65I、r27RCL-D66T、r27RCL-K68T酶学特性分析 3.4 结果与分析 3.4.1 突变体脂肪酶r27RCL-K64N、r27RCL-W65I、r27RCL-D66T、r27RCL-K68T真核表达载体的构建 3.4.1.1 重组质粒pPIC9K-r27RCL-K64N、 pPIC9K-r27RCL-W65I、pPIC9K-r27RCL-D66T、pPIC9K-r27RCL-K68T的获得 3.4.1.2 重组质粒pPIC9K-r27RCL-K64N、 pPIC9K-r27RCL-W65I、pPIC9K-r27RCL-D66T、pPIC9K-r27RCL-K68T的转化 3.4.2 重组脂肪酶r27RCL-K64N、r27RCL-W65I、r27RCL-D66T、r27RCL-K68T在毕赤酵母中的高效表达 3.4.3 重组脂肪酶r27RCL-K64N、r27RCL-W65I、r27RCL-D66Tr27RCL-K68T的纯化、鉴定及定量 3.4.4 重组脂肪酶r27RCL、r27RCL-K64N、r27RCL-W65I、r27RCL-D66T和r27RCL-K68T的酶学性质研究 3.4.4.1 脂肪酶的活性分析 3.4.4.2 重组脂肪酶r27RCL、r27RCL-K64N、r27RCL-W65I、r27RCL-D66T和r27RCL-K68T的最适pH和pH稳定性测定 3.4.4.3 重组脂肪酶r27RCL、r27RCL-K64N、r27RCL-W65I、r27RCL-D66T和r27RCL-K68T的最适温度和热稳定性测定 3.4.4.4 不同金属离子及化学试剂对重组脂肪酶r27RCL、r27RCL-K64N、r27RCL-W65I、r27RCL-D66T和r27RCL-K68的活力的影响 3.4.4.5 重组脂肪酶r27RCL、r27RCL-K64N、r27RCL-W65I、r27RCL-D66T和r27RCL-K68的动力学参数 3.5 讨论 3.6 本章小节第4章 构建二硫键对华根霉脂肪酶酶学特性的改造 4.1 确定华根霉脂肪酶的突变位点 4.2 实验材料 4.3 实验方法 4.3.1 突变体脂肪酶r27RCL-T201C真核表达载体的构建 4.3.1.1 突变体脂肪酶r27RCL-T201C引物的设计 4.3.1.2 定点突变和转化、突变后阳性筛选的鉴定与检测 4.3.2 重组脂肪酶r27RCL-T201C在毕赤酵母中的高效表达、凝胶电泳检测及蛋白含量测定、酶活测定、酶学特性分析 4.4 结果与分析 4.4.1 突变体脂肪酶r27RCL-T201C真核表达载体的构建 4.4.1.1 重组质粒pPIC9K-r27RCL-T201C的获得 4.4.1.2 重组质粒pPIC9K-r27RCL-T201C的转化 4.4.2 重组脂肪酶r27RCL-T201C在毕赤酵母中的高效表达 4.4.3 重组脂肪酶r27RCL-T201C的纯化、鉴定及定量 4.4.4 重组脂肪酶r27RCL、r27RCL-T201C的酶学性质研究 4.4.4.1 重组脂肪酶r27RCL-T201C的活性分析 4.4.4.2 重组脂肪酶r27RCL和r27RCL-T201C的最适pH和pH稳定性测定 4.4.4.3 重组脂肪酶r27RCL和r27RCL-T201C的最适温度和热稳定性测定 4.4.4.4 不同金属离子及化学试剂对重组脂肪酶r27RCL和r27RCL-T201C的活力的影响 4.4.4.5 重组脂肪酶r27RCL和r27RCL-T201C的动力学参数 4.5 讨论 4.6 本章小节第5章 总结与展望 5.1 总结 5.2 创新 5.3 展望参考文献附录 附录A 实验中所使用的缓冲液的配制 附录B 本文所涉及到的氨基酸序列 附录C 氨基酸中英文对照及缩写表攻读学位期间发表的学术论文和研究成果致谢
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 姜占宝
导师: 黄遵锡,韩楠玉
关键词: 脂肪酶,基因融合,定点突变,热稳定性,二硫键
来源: 云南师范大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 云南师范大学
分类号: Q55
总页数: 104
文件大小: 3522K
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标签：脂肪酶论文; 基因融合论文; 定点突变论文; 热稳定性论文; 二硫键论文;
