禽多瘤病毒的分离鉴定及荧光定量PCR检测方法的建立

论文摘要

禽多瘤病（Avian polyomavirus disease）,又称鹦鹉幼雏病（Budgerigar Fledgling Disease,BFD）,是一种由禽多瘤病毒（Avian Polyomavirus,APV）引起的急性传染病,可感染多个品种的鸟,但主要引起鹦鹉幼雏发病,该病能引起鹦鹉幼雏呼吸困难,羽毛发育不全、生长迟缓、消瘦等症状并最终导致死亡。20世纪末传入我国,曾在我国湖北、山东、福建等省份爆发,给当地的鹦鹉养殖企业带来巨大损失。而到目前为止尚无针对禽多瘤病的有效疫苗及治疗方法,因此,开展对APV的相关研究有着重要意义。本实验从疑似禽多瘤病发病鹦鹉的肝脏中分离到一株病毒,基因序列分析和动物回归试验结果表明分离的病毒为禽多瘤病毒。试验建立了一种SYBR Green荧光定量PCR（qPCR）方法以期能够用于禽多瘤病的临床诊断。通过建立的荧光定量PCR方法对APV在鹦鹉胚成纤维细胞上的增殖情况进行了研究,绘制了病毒增殖曲线。具体试验结果如下:1.试验采集了陕西临潼地区的疑似禽多瘤病毒感染的病料,并用15日胚龄的健康鹦鹉胚制备了鹦鹉胚成纤维（BEF）原代细胞,通过将病料悬液接种到BEF细胞分离到了一株病毒,对分离病毒的VP1基因进行序列分析,发现该病毒与NCBI上公布的11株来自世界各地的禽多瘤病毒核苷酸、氨基酸序列同源性达99%以上,其中与我国山东、日本的分离株的同源性达100%。将分离的病毒接种健康的鹦鹉幼雏,其发病症状、病理变化与禽多瘤病的相似,从而证实分离的病毒为禽多瘤病毒。2.试验构建了209 bp的APV阳性标准质粒,通过荧光定量PCR测定经过10倍倍比稀释的标准质粒,得到标准曲线Y=﹣3.255X+40.867,从而建立了一种SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法。对该方法的多个方面进行评估,试验结果表明,以4型禽腺病毒、H9N2型禽流感病毒、新城疫病毒作为模板时,均未检测到有效荧光信号,仅禽多瘤病毒出现了特异性扩增曲线;在灵敏性试验中,建立的荧光定量PCR方法相较于普通PCR其灵敏度高出100倍;在重复性试验中,组内重复试验与组间重复试验变异系数分别小于0.5%、1.5%。用该方法检测临床样品,30份样品检出24份阳性,其检出率高于普通PCR。综上,试验所建立的禽多瘤病毒荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点。3.利用建立的荧光定量PCR测定了禽多瘤病毒在接种到鹦鹉胚成纤维细胞后不同时间点的病毒拷贝数,并根据测定得出的数据绘制了病毒增殖曲线,发现该病毒接种鹦鹉胚成纤维细胞12 h后开始大量复制,接种后60 h达到最大病毒滴度。这为以后大规模增殖禽多瘤病毒提供了重要的参考。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要符号对照表
• 文献综述
•   第一章 禽多瘤病研究进展
•     1.1 禽多瘤病毒概述
•       1.1.1 多瘤病毒分类
•       1.1.2 禽多瘤病毒病原特征
•       1.1.3 禽多瘤病毒基因结构
•     1.2 禽多瘤病的临床症状及组织病理变化
•       1.2.1 临床症状
•       1.2.2 组织病理学变化
•     1.3 禽多瘤病的易感性
•     1.4 禽多瘤病毒传播途径
•     1.5 禽多瘤病毒检测方法
•       1.5.1 病毒分离鉴定
•       1.5.2 分子生物学诊断
•       1.5.3 血清学诊断
•     1.6 禽多瘤病的预防及治疗
•     1.7 本研究目的意义
• 试验研究
•   第二章 禽多瘤病毒的分离鉴定
•     2.1 材料
•       2.1.1 病料、鹦鹉胚、鹦鹉幼雏
•       2.1.2 主要仪器、设备
•       2.1.3 主要试剂
•     2.2 方法
•       2.2.1 病料剖检及采样
•       2.2.2 病料DNA提取
•       2.2.3 临床样品的PCR检测
•       2.2.4 鹦鹉胚成纤维细胞（BEF）的制作与冻存
•       2.2.5 禽多瘤病毒的分离培养
•       2.2.6 APV分离毒株的PCR鉴定
•       2.2.7 APV分离株的VP1 基因序列分析
•       2.2.8 动物回归试验
•     2.3 结果
•       2.3.1 禽多瘤病临床症状及病理变化观察
•       2.3.2 禽多瘤病毒的分离培养
•       2.3.3 APV分离毒株PCR鉴定结果
•       2.3.4 APV分离株的VP1 基因序列分析
•       2.3.5 动物回归试验
•     2.4 讨论
•     2.5 小结
•   第三章 禽多瘤病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用
•     3.1 材料
•       3.1.1 毒株
•       3.1.2 主要仪器、设备
•       3.1.3 主要试剂
•     3.2 方法
•       3.2.1 引物设计与合成
•       3.2.2 病毒核酸提取
•       3.2.3 阳性标准质粒的制备与合成
•       3.2.4 阳性标准质粒浓度测定及拷贝数计算
•       3.2.5 荧光定量PCR程序优化
•       3.2.6 标准曲线的建立
•       3.2.7 特异性试验
•       3.2.8 敏感性试验
•       3.2.9 重复性试验
•       3.2.10 临床样品检测
•       3.2.11 荧光定量PCR方法检测APV在 BEF上的增殖情况
•     3.3 结果
•       3.3.1 阳性标准质粒的制备与合成
•       3.3.2 阳性标准质粒浓度测定及拷贝数计算
•       3.3.3 荧光定量PCR程序优化
•       3.3.4 标准曲线的建立
•       3.3.5 特异性试验
•       3.3.6 敏感性试验结果
•       3.3.7 重复性试验结果
•       3.3.8 临床样品检测
•       3.3.9 APV在 BEF上的增殖情况
•     3.4 讨论
•     3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘艳

导师: 王晶钰

关键词: 禽多瘤病毒,鹦鹉胚成纤维细胞,分离鉴定,荧光定量,病毒增殖

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 2018科技成果推广-多学科产业服务与国际合作项目(00500,Z222021811)

分类号: S852.65

总页数: 60

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