盘尾丝虫ASP1蛋白佐剂活性区不同标签融合表达与免疫佐剂活性研究

论文摘要

盘尾丝虫活化相关分泌蛋白1（Ov-ASP-1）核心致病性相关结构域-1（PR1）具有很强的免疫佐剂活性,但先前报道的重组PR1带有组氨酸融合标签,不仅需用价格较贵的镍亲和层析柱纯化,而且因分子量较小容易降解。本研究将Ov-ASP-1 PR1分别与类弹性蛋白多肽（ELP）和ELK16自聚肽融合表达,以传染性法氏囊病病毒（IBDV）重组VP2蛋白为模式抗原进行小鼠免疫试验,旨在简化重组PR1纯化工艺和探明不同纯化标签对PR1免疫佐剂活性的影响。首先将IBDV VP2基因序列优化成大肠杆菌密码子序列,5’端引入烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切位点,将合成序列插入pET-ELP载体,将重组载体pELP-VP2转化大肠杆菌,用IPTG诱导融合蛋白表达,结果显示重组菌表达预期的67kDa融合蛋白。对ELP-VP2融合蛋白的相变温度和盐离子浓度进行优化,结果显示相变温度为28℃C,氯化钠浓度为2 mol/L。在优化条件下进行一次相变循环（ITC）,纯化的ELP-VP2纯度为96%,产量为24mg/L。用TEV蛋白酶活性包涵体在30℃切割ELP-VP2融合蛋白6 h,切割效率为86%。用再次ITC去除ELP标签,回收的无标签重组VP2纯度为95%,产量为24 mg/L,能被IBDV VP2单抗识别。这些结果表明ELP是有效的重组蛋白纯化标签,制备的重组VP2可作为IBD亚单位疫苗进一步研发。将Ov-ASP-1 PR1基因片段分别插入ELP、ELK16和His标签融合表达载体,将重组载体pELP-PR1、pELK16-PR1和pET-PR1转化大肠杆菌,用IPTG诱导融合蛋白表达,结果显示重组菌分别表达预期的60、28和23 kDa融合蛋白,其中ELP-PR1为可溶性表达,ELK16-PR1为活性包涵体表达,His-PR1为不溶性包涵体表达。分别用相变循环、离心洗涤和镍层析柱纯化融合蛋白,结果显示纯化的融合蛋白纯度分别为92%、95%和97%,产量分别为38 mg/L、96 mg/L和134 mg/L。这些结果表明ELP和ELK16自聚肽有效的重组蛋白纯化标签。分别用 VP2+ELP-PR1、VP2+ELK16-PR1 和 VP2+His-PR1 免疫小鼠,设 VP2 和 VP2+IFA（弗氏不完全佐剂）免疫对照组,首免后2周加强免疫一次,首免后第7、14、21和28天采血并收集血清,用间接ELISA测定免疫小鼠血清的特异IgG、IgG1和IgG2c;首免后28天扑杀小鼠,分离培养脾淋巴细胞,用WST-1法检测免疫小鼠脾细胞刺激指数,用试剂盒检测IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-10表达水平。结果显示在初免后第7天,His-PR1佐剂组总IgG水平与VP2免疫组差异显著（P<0.05）,IFA、ELK16-PR1和ELP-PR1佐剂组差异极显著（P<0.01）,其中ELP+PR1佐剂组总IgG水平最高;His-PR1和IFA佐剂组IgG1水平与VP2免疫对照组差异不显著,ELP-PR1和ELK16-PR1佐剂组差异显著;4个佐剂组IgG2c水平与VP2免疫组差异极显著,其中ELP-PR1佐剂组IgG2c水平最高。初免后第28天,4个佐剂组总IgG水平与VP2免疫组差异极显著,其中ELP-PR1佐剂组总IgG水平最高;His-PR1佐剂组IgG1水平与VP2免疫组差异显著,其他3个佐剂组差异极显著;4个佐剂组IgG2c水平与VP2免疫组差异极显著,其中ELP-PR1佐剂组IgG2c水平最高。五个免疫组的脾细胞刺激指数分别为9.11±0.32、11.04±0.57、28.9±0.3、12.06±0.24和10.86±0.11,ELP-PR1佐剂组比VP2免疫组差异显著（P<0.01）,其余佐剂组差异不显著。ELP-PR1佐剂组IFN-y水平比VP2免疫组差异极显著,其他3个佐剂组差异不显著;ELK16-PR1佐剂组IL-6水平比VP2免疫组差异显著,ELP-PR1佐剂组差异极显著;ELP-PR1免疫组IL-10水平比VP2免疫组差异极显著,其他3个佐剂组差异显著。这些研究结果表明携带不同融合标签的PR1仍保留免疫佐剂活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 综述: 疫苗佐剂研究进展
•   1 概述
•     1.1 免疫佐剂种类
•     1.2 新型免疫佐剂
•     1.3 寄生虫产物佐剂
•   2 盘尾丝虫ASP1
•     2.1 概述
•     2.2 结构特点
•     2.3 作用机制
•     2.4 作为疫苗佐剂的应用
•     2.5 活性功能区
• 研究内容一: IBDV重组VP2抗原的表达与纯化
•   1 材料与方法
•     1.1 试剂与耗材
•     1.2 生物材料
•     1.3 设备
•     1.4 表达载体构建
•     1.5 融合蛋白诱导表达
•     1.6 融合蛋白纯化
•     1.7 融合蛋白鉴定
•     1.8 TEV蛋白酶活性包涵体制备
•     1.9 ELP标签切割
•     1.10 重组VP2回收
•   2 结果
•     2.1 表达载体鉴定
•     2.2 融合蛋白表达分析
•     2.3 融合蛋白纯化
•     2.4 融合VP2蛋白鉴定
•     2.5 酶切时间优化
•     2.6 ELP标签切除和VP2蛋白回收
•   3 讨论
• 研究内容二: ASP-1佐剂活性区的不同标签融合表达与纯化
•   1 材料与方法
•     1.1 试剂与耗材
•     1.2 生物材料
•     1.3 设备
•     1.4 表达载体构建
•     1.5 蛋白表达及分析
•     1.6 ELP-PR1纯化
•     1.7 ELK16-PR1纯化
•     1.8 His-PR1纯化
•   2 结果
•     2.1 表达载体鉴定
•     2.2 蛋白表达及分析
•     2.3 ELP-PR1融合蛋白纯化
•     2.4 ELK16-PR1融合蛋白纯化
•     2.5 His-PR1融合蛋白纯化
•     2.6 融合蛋白纯化
•   3 讨论
• 研究内容三: 不同融合标签对PR1免疫佐剂活性的影响
•   1 材料与方法
•     1.1 试剂与耗材
•     1.2 实验动物
•     1.3 设备
•     1.4 小鼠免疫程序
•     1.5 抗体水平检测
•     1.6 脾细胞增殖指数检测
•     1.7 细胞因子检测
•   2 结果
•     2.1 免疫小鼠抗体测定
•     2.2 免疫小鼠脾细胞增殖指数测定
•     2.3 免疫小鼠血清细胞因子测定
•   3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录: 主要培养基与缓冲液配制方法
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 胡威

导师: 孙怀昌

关键词: 盘尾丝虫,不同标签融合表达,佐剂活性比较

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 扬州大学

基金: 国家重点研发计划项目资助(2017YFNC0201303,2018YFC08404004),江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)

分类号: Q78

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000294

总页数: 70

文件大小: 4815K

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