NDRG1在卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）潜伏感染中的功能机制研究

论文摘要

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus,KSHV）是一种致瘤的人类DNA疱疹病毒,能导致多种肿瘤的发生,包括卡波氏肉瘤、原发性浸出淋巴瘤和多中心性卡斯特曼病等恶性肿瘤。KSHV作为一种疱疹病毒,能在宿主体内建立终身潜伏感染。处于潜伏期的KSHV病毒基因组,以染色体外附加体（episome）的形式系挂在宿主染色体上,并会随着宿主细胞每个细胞周期的染色体复制而复制,并随着细胞的分裂而平均分配到子代细胞中,从而保证较为稳定的病毒拷贝数长期存在于宿主细胞内。KSHV病毒潜伏感染的建立和维持对病毒持续感染和致瘤均十分关键,因此进一步阐明KSHV潜伏感染的分子机制十分必要。本研究中,我们通过RNA深度测序、基因芯片、和iTRAQ多种组学技术筛选,鉴定了一个新的宿主蛋白N-Myc下游调节基因1（N-Myc downstream regulated gene 1,NDRG1）在KSHV感染的各类细胞系和卡波氏肉瘤组织中高表达。通过KSHV病毒从头感染实验,我们确定了KSHV病毒可以显著上调细胞内NDRG1的表达水平,并进一步发现KSHV编码的潜伏态相关核抗原（Latency associated nuclear antigen,LANA）对上调NDRG1表达起关键作用。为了探索NDRG1在KSHV感染过程中发挥的功能,我们敲低了KSHV潜伏感染的原发渗出性淋巴瘤细胞中的NDRG1,发现KSHV基因组拷贝数发生明显下降,病毒基因组发生丢失。为了寻找其内在机制,我们通过串联亲和层析联合质谱的技术,发现NDRG1能与增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）相互作用,而后者是一种在DNA复制过程中起着DNA聚合酶夹作用的蛋白。有趣的是,我们发现NDRG1不仅与PCNA发生直接相互作用,它还发挥桥梁作用介导LANA招募PCNA至KSHV基因组复制起始位点区域--末端重复序列（Terminal repeat,TR）,从而有利于病毒基因组的复制和病毒附加体在细胞中的长期稳定维持。综上所述,本研究首次发现NDRG1在KSHV病毒基因组复制中发挥重要作用并阐明其功能机制,为进一步探索KSHV潜伏感染机制提供了新的线索。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第1章 引言
•   1.1 卡波氏肉瘤相关疱疹病毒
•     1.1.1 KSHV的发现
•     1.1.2 KSHV相关疾病及分布
•     1.1.3 KSHV病毒基因组
•     1.1.4 KSHV的生命周期
•     1.1.5 研究KSHV潜伏感染期的主要细胞模型
•   1.2 潜伏态KSHV病毒基因组的稳定性
•     1.2.1 LANA是影响基因组复制和稳定性的关键病毒分子
•     1.2.2 潜伏期KSHV基因组复制机制
•   1.3 N-myc下游调节基因1（NDRG1）
•   1.4 研究内容
• 第2章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 细胞系
•     2.1.2 质粒
•     2.1.3 抗体及试剂
•     2.1.4 仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 质粒的小量制备
•     2.2.2 细胞转染用超纯质粒的制备
•     2.2.3 质粒DNA的酶切、片断回收与连接
•     2.2.4 细胞总RNA和基因组DNA的提取
•     2.2.5 转录组和蛋白质组分析
•     2.2.6 逆转录PCR（RT-PCR）
•     2.2.7 荧光实时定量PCR（Real-time PCR）
•     2.2.8 Western Blot检测蛋白在细胞中的表达
•     2.2.9 免疫组织化学染色（IHC）
•     2.2.10 免疫荧光分析（immunofluoresence analysis,IFA）
•     2.2.11 KSHV病毒的制备和感染
•     2.2.12 慢病毒包装和细胞稳转株构建
•     2.2.13 细胞的转染和转导
•     2.2.14 DNA荧光原位杂交
•     2.2.15 免疫共沉淀（Co-IP）
•     2.2.16 串连亲和层析（TAP-MS）
•     2.2.17 蛋白纯化和体外结合实验
•     2.2.18 染色质免疫沉淀（ChIP）
•     2.2.19 体外DNA下拉蛋白实验（DNA Pull down assay）
•     2.2.20 LANA介导的DNA复制功能的检测
•     2.2.21 检测TR质粒在细胞中长期维持的能力
• 第3章 实验结果
•   3.1 KSHV感染的KMM细胞和对照MM细胞中表达差异基因的鉴定
•     3.1.1 RNA-seq深度测序差异表达基因的筛选
•     3.1.2 mRNA芯片差异表达基因的筛选
•     3.1.3 iTRAQ蛋白组数据差异表达基因的筛选
•     3.1.4 转录水平和蛋白水平关联分析
•     3.1.5 候选差异基因的鉴定
•   3.2 NDRG1在KSHV感染的各类细胞和卡波氏肉瘤组织中高表达
•   3.3 KSHV从头感染（de novo infection）上调NDRG1 基因的表达水平
•   3.4 LANA促进NDRG1 基因上调
•     3.4.1 LANA维持NDRG1在KSHV潜伏期细胞中的高表达
•     3.4.2 LANA参与诱导NDRG1 的上调表达
•   3.5 KSHV基因组拷贝数在敲低NDRG1 的细胞中明显下降
•   3.6 NDRG1 和宿主DNA复制相关蛋白PCNA相互作用
•   3.7 LANA、NDRG1和PCNA三者形成复合物
•   3.8 NDRG1 发挥桥梁作用介导LANA招募PCNA至 KSHV基因组
•   3.9 NDRG1 促进LANA介导的病毒基因组复制和附加体的维持
• 第4章 结论
• 第5章 讨论
•   5.1 宿主分子NDRG1 在病毒感染中的生物学功能
•   5.2 KSHV对 NDRG1 基因的表达调控
•   5.3 潜伏态KSHV病毒基因组的复制
• 参考文献
• 附录
•   附录1 构建表达载体所用引物列表
•   附录2 Realtime-PCR所用引物列表
•   附录3 ChIP所用引物列表
•   附录4 通过比较Microarray微阵列和iTRAQ数据库得到的差异表达基因
•   附录5 通过比较RNA-seq和 iTRAQ数据库得到的差异表达基因
•   附录6 通过比较RNA-seq、Microarray和 iTRAQ数据库得到的差异表达基因
•   附录7 TAP-MS技术鉴定的与NDRG1 相互作用的核蛋白
• 致谢
• 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果
• 专业综述
•   参考文献

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张芳

导师: 梁小珍,蓝柯

关键词: 卡波氏肉瘤相关疱疹病毒,复制,潜伏相关核抗原

来源: 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

分类号: R373

DOI: 10.27915/d.cnki.gkbsd.2019.000009

总页数: 148

文件大小: 4413K

下载量: 30