EV71入侵树鼩血-脊髓屏障的机制研究

论文摘要

肠道病毒71型（Enterovirus71,EV71）属于小RNA病毒科肠道病毒属,是引起婴幼儿手足口病主要病原体之一,其感染除引发手足口病症状外,还具有神经噬性,少数的重症感染者会出现严重的中枢神经系统并发症,如无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿和急性迟缓性麻痹等。但EV71的致病机制尚不完全明确,关于EV71如何侵入神经系统并造成神经损伤的通路也还不清楚,有研究认为EV71病毒可能通过血-脑屏障（BBB）从血液传播到中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）,但还没有确凿的证据。本研究在前期研究基础上,通过体外分离培养树鼩脊髓微血管内皮细胞,探究EV71感染受体以及血-脊髓屏障结构通透性相关的分子特性,结合树鼩体内感染实验,以探讨EV71入侵神经系统的机制,这有助于临床重症患者治疗和疫苗研发。首先,体外分离纯化了树鼩的脊髓微血管内皮细胞（SCMECs）和脊髓星形胶质细胞（SCASTs）,经细胞免疫荧光鉴定其纯度。其后使用EV71分别感染这两种细胞,采用细胞免疫荧光检测EV71相应抗原分子,real-time PCR检测细胞和培养上清中的病毒载量并绘制病毒增殖曲线;主要研究EV71感染脊髓微血管内皮细胞的特征,并通过选取多个感染时间点利用real-time PCR检测EV71感染SCMECs相关受体和屏障相关蛋白的表达情况。其次,进行了树鼩的体内感染实验。共选取3月龄树鼩16只,实验组12只经灌胃和滴鼻模拟自然感染途径对其进行攻毒,隔天检测血清中的病毒载量,测量体温、体重。对照组4只以相同途径给予细胞维持液。检测攻毒第7天和20天的树鼩各组织中的病毒载量,免疫组化检测脑和脊髓组织中的EV71分布,并对各器官组织作病理检测;同时,通过注射伊文思蓝染料后取脑和脊髓制成冷冻切片,根据荧光范围分析屏障通透性变化情况。结果显示,建立的分离纯化方法可获得较高纯度的两种细胞并用于后续实验;EV71感染SCMECs和SCASTs后细胞均出现明显细胞病变,细胞免疫荧光在两种细胞中都能检测到EV71抗原分子;病毒增殖动力曲线表明EV71在两种细胞中均能快速增殖,且在感染24小时前后载量达到峰值（1×109copies/mL）,说明SCMECs和SCASTs能被EV71病毒感染。qPCR检测SCMECs的EV71感染受体和屏障相关蛋白,结果显示SCMECs细胞具有EV71感染主要受体:SCARB2、Anx2,并在感染后表达量升高;血-脊髓屏障相关的分子ZO-1和JAM-1表达量明显下降,Occludin、Claudin-1、Claudin-5 呈现先下降后上升的趋势,MMP-9、MMP-2 和 MMP-12在感染后表现出表达上调;MFSD2a在感染12h前出现明显上调,在12小时后出现快速的下调。树鼩体内感染实验显示在攻毒后表现出发热和生长变缓（消瘦）的症状,血清中持续检测到EV71载量,第7天达到峰值（1.31×105copies/mL）;在心、肝、脾、肺、肾、脑和脊髓中检测到EV71病毒载量,脑和脊髓中的病毒载量分别达到4.98×105 copies/mL和8.27×105 copies/mL,至感染20天仍能在脑和脊髓检测到病毒,免疫组化也在脑和脊髓中检测到EV71;病理结果显示各组织脏器中均出现一定程度的病理异常,特别是脑组织出现脑膜下血管充血,大脑皮质充血,神经细胞空泡变性和脊髓组织血管充血;冷冻切片结果也显示攻毒组树鼩脑和脊髓中伊文思蓝扩散至血管外渗入组织中,血管通透性明显增强。这些结果表明攻毒后树鼩产生了明显的病毒血症,EV71入侵至各组织引起组织病变,包括脑和脊髓;树鼩存在EV71感染相关受体,很可能介导了病毒的入侵过程;EV71的入侵伴随有血-脊髓屏障通透性的变化,这种变化很可能与其入侵神经并形成神经损伤密切相关。综上,本研究中分离的SCMECs和SCASTs可用于后续相关的实验研究;EV71可感染SCMECs和SCASTs,SCMECs具有EV71感染相关的受体,且在感染后出现明显的表达上调,血-脊髓屏障相关的分子蛋白表达变化明显;由此推断EV71可以通过感染SCMECs细胞或其他屏障相关的细胞入侵神经系统,由相关感染受体介导入胞,而EV71的入侵可破坏血-脊髓屏障的完整性或导致屏障通透性增加,进而造成脊髓组织的神经损伤。提示树鼩可以作为EV71研究的良好动物模型。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 树鼩脊髓星形胶质细胞细胞分离鉴定
•   1. 实验材料与方法
•     1.1 实验材料
•       1.1.1 实验动物
•       1.1.2 实验试剂
•       1.1.3 仪器
•     1.2 实验方法
•       1.2.1 脊髓原代星形胶质细胞（Spinal cord Astroglia:SCASTs）分离
•       1.2.2 星形胶质细胞纯化培养
•       1.2.3 星形胶质细胞的形态学观察及鉴定
•     1.2.3.1 形态学观察
•     1.2.3.2 星形胶质细胞免疫荧光鉴定
•       1.2.4 MTT法测定星形胶质细胞生长曲线
•       1.2.5 星形胶质细胞冻存、复苏
•   2. 实验结果
•     2.1 形态学观察
•     2.2 细胞免疫荧光染色
•     2.3 树鼩星形胶质细胞生长曲线
•   3. 讨论
• 第二章 树鼩脊髓微血管内皮细胞分离鉴定
•   1. 实验材料与方法
•     1.1 实验材料
•       1.1.1 实验动物
•       1.1.2 实验试剂
•       1.1.3 仪器
•     1.2 实验方法
•       1.2.1 树鼩脊髓微血管内皮细胞分离
•       1.2.2 脊髓微血管内皮细胞的纯化培养
•       1.2.3 脊髓微血管内皮细胞的形态学观察及鉴定
•     1.2.3.1 形态学观察
•     1.2.3.2 脊髓微血管内皮细胞免疫荧光鉴定
•       1.2.4 MTT法测定脊髓微血管内皮细胞生长曲线
•       1.2.5 脊髓微血管内皮细胞冻存和复苏
•   2. 实验结果
•     2.1 形态学观察
•     2.2 细胞免疫荧光染色
•     2.3 脊髓微血管内皮细胞生长曲线
•   3. 讨论
• 第三章 EV71感染树鼩脊髓微血管内皮细胞和星形胶质细胞
•   1. 实验材料与方法
•     1.1 实验材料
•       1.1.1 细胞
•       1.1.2 病毒
•       1.1.3 试剂及材料
•       1.1.4 仪器
•     1.2 实验方法
•       1.2.1 EV71病毒增殖
•       1.2.2 EV71病毒滴度测定
•       1.2.3 确定最佳感染复数
•       1.2.4 病毒增殖动力曲线测定
•       1.2.5 EV71感染脊髓微血管内皮细胞和星形胶质细胞的相关特性
•     1.2.5.1 免疫荧光检测EV71感染后细胞中的病毒颗粒
•     1.2.5.2 EV71感染相关受体及血-脊髓屏障相关蛋白表达测定
•   2. 实验结果
•     2.1 EV71感染的最佳感染复数
•     2.2 EV71感染细胞的增殖动力曲线
•     2.3 细胞免疫荧光检测EV71感染细胞
•     2.4 EV71感染相关受体及血-脊髓屏障相关蛋白表达测定
•   3. 讨论
• 第四章 EV71感染树鼩
•   1. 实验材料与方法
•     1.1 实验材料
•       1.1.1 实验动物
•       1.1.2 病毒
•       1.1.3 试剂及材料
•       1.1.4 仪器
•     1.2 实验方法
•       1.2.1 动物选取
•       1.2.2 动物攻毒
•       1.2.3 尾静脉采血和体重体温测量
•       1.2.4 血清总RNA提取和血清EV71病毒载量检测
•       1.2.5 组织取样
•       1.2.6 各组织总RNA提取
•       1.2.7 Real-time PCR检测各组织中EV71病毒载量
•       1.2.8 各组织的病理切片检测
•       1.2.9 免疫组化检测脑和脊髓中的EV71
•       1.2.10 qPCR检测脊髓中屏障相关蛋白表达情况
•       1.2.11 伊文思兰染色检测血-脊髓屏障通透性
•   2. 实验结果
•     2.1 攻毒后树鼩的体温和体重变化情况
•     2.2 血清中EV71病毒载量
•     2.3 各组织病毒载量
•     2.4 各组织病理检测结果
•     2.5 免疫组化结果
•     2.6 感染后脊髓中屏障相关蛋白表达
•     2.7 伊文思兰染色检测血-脊髓屏障通透性
•   3. 讨论
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 附录一 英文缩略语表
• 附录二 主要细胞培养溶液配制
• 致谢
• 研究生简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王璇

导师: 孙晓梅

关键词: 树鼩,血脊髓屏障,脊髓微血管内皮细胞

来源: 北京协和医学院

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 北京协和医学院

分类号: R373

DOI: 10.27648/d.cnki.gzxhu.2019.000409

总页数: 80

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