苹果MdHMGR5基因的克隆及其在氧化胁迫下的功能分析

论文摘要

萜类化合物是维持植物生长发育及应对环境胁迫所必需的重要物质,在医药、农业、食品以及工业上具有重要的商业价值。近年来,萜类代谢工程已成为植物次生代谢的热点研究领域,研究萜类代谢途径中关键酶基因的功能具有重要的意义。HMGR是甲羟戊酸途径上游调控萜类合成的第一个限速酶,能够将乙酰辅酶A转化为甲羟戊酸。在高等植物中,HMGR基因常以基因家族的形式存在,其对植物的生长发育以及应对各种环境胁迫具有重要的作用。实验室前期从苹果基因组中鉴定得到8个HMGR基因,本研究以此为基础,首先分析了苹果HMGR基因家族成员在激素诱导和逆境胁迫下的表达模式,并成功克隆到MdHMGR5基因,然后构建过表达载体,转化拟南芥,得到了过表达MdHMGR5转基因拟南芥株系。本研究对MdHMGR5基因的功能进行了探究,主要研究结果如下:（1）激素诱导表达分析表明,苹果HMGR基因家族不同成员呈现出不同的表达模式。胁迫响应分析表明,在低温和机械伤害处理后,苹果HMGR基因家族各成员均出现不同程度的上调,表明苹果HMGR基因可能参与到低温和伤害胁迫的防御过程中。在氧化胁迫处理后,MdHMGR5基因的表达量上调最为显著,推测该基因在植物氧化胁迫耐受性的调控中相对其它基因可能发挥更大的功能。而MdHMGR1和MdHMGR4基因在干旱胁迫下表达量上调。（2）MdHMGR5组织表达分析结果表明,该基因在苹果的各个部位均有表达,其中在根中的表达量最高;克隆得到MdHMGR5基因,构建35S启动子启动的pROKⅡ-GFP真核表达载体,在本生烟中进行了瞬时转化,亚细胞定位结果显示,MdHMGR5蛋白定位在细胞膜上;将表达载体转化拟南芥,对转基因拟南芥进行基因组水平和转录组水平鉴定,筛选出三个阳性转基因株系进行后续实验。（3）HMGR酶活性测定结果表明,该基因的导入提升了转基因拟南芥的HMGR酶活性。（4）用HMGR抑制剂洛伐他汀和美伐他汀处理拟南芥种子,观察统计种子萌发和幼根生长状况。结果显示,与野生型植株相比,转基因拟南芥种子萌发率较高,主根较长,说明过表达MdHMGR5基因降低了拟南芥对抑制剂的敏感性。（5）用甲基紫精模拟氧化胁迫对拟南芥种子进行处理,测定拟南芥的抗氧化能力。结果显示,与野生型相比,转基因拟南芥种子萌发率较高,主根较长。进一步对拟南芥成苗进行氧化胁迫处理,结果发现,在正常条件下各株系的生长状况没有明显差别,氧化胁迫后,转基因拟南芥萎蔫失水失绿程度明显低于野生型植株。这些结果说明过表达MdHMGR5增强了拟南芥对氧化胁迫的耐受性。（6）与野生型植株相比,转基因拟南芥在氧化胁迫下具有更高的叶绿素和脯氨酸含量以及抗氧化酶（SOD、APX和CAT）和HMGR酶活性,同时MDA含量、相对电导率和活性氧的生成速率显著低于野生型。这些结果表明MdHMGR5过表达通过清除ROS来增强植株对氧化胁迫的耐受性。（7）过表达MdHMGR5影响了拟南芥中萜类MVA途径和MEP途径相关基因的表达量。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
•   1.1 植物次生代谢
•   1.2 萜类化合物概述
•     1.2.1 萜类化合物的种类
•     1.2.2 萜类合成途径及其交流
•     1.2.3 萜类化合物的功能和用途
•   1.3 植物HMGR的研究进展
•     1.3.1 HMG-CoA还原酶及其催化机理
•     1.3.2 HMGR蛋白的结构特点
•     1.3.3 HMGR基因的克隆
•     1.3.4 HMGR基因的调控及表达
•     1.3.5 HMGR基因的生物学功能
•     1.3.6 抑制剂对HMGR基因的影响
•   1.4 萜类代谢途径相关酶
•     1.4.1 异戊烯基焦磷酸异构酶（IPI）
•     1.4.2 法呢基焦磷酸合酶（FPS）
•     1.4.3 α-法尼烯合酶（AFS）
•     1.4.4 1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）
•     1.4.5 脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶（DXR）
•   1.5 活性氧（ROS）清除系统
•   1.6 本实验的目的意义
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 材料培养与处理
•     2.1.3 载体与菌株
•     2.1.4 酶与试剂
•     2.1.5 实验引物
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 植物总RNA提取
•     2.2.2 cDNA第一链的合成
•     2.2.3 实时荧光定量PCR
•     2.2.4 表达载体的构建
•       2.2.4.1 基因克隆
•       2.2.4.2 连接
•       2.2.4.3 重组载体转化大肠杆菌
•       2.2.4.4 菌落筛选
•       2.2.4.5 重组质粒的酶切鉴定
•       2.2.4.6 根癌农杆菌GV3101 的制备
•       2.2.4.7 冻融法转化农杆菌
•     2.2.5 MdHMGR5 蛋白亚细胞定位
•     2.2.6 花浸法转化拟南芥
•     2.2.7 转基因植株的鉴定
•       2.2.7.1 基因水平鉴定转基因植株
•       2.2.7.2 qRT-PCR转录水平鉴定转基因植株
•     2.2.8 转基因拟南芥HMGR酶活性测定
•       2.2.8.1 植物总蛋白的提取
•       2.2.8.2 HMGR酶活性分析
•     2.2.9 转基因拟南芥对抑制剂敏感性的测定
•     2.2.10 转基因植株生理指标测定
•       2.2.10.1 拟南芥种子萌发率和根长的统计
•       2.2.10.2 相对含水量的测定
•       2.2.10.3 丙二醛、脯氨酸含量和伤害程度的测定
•       2.2.10.4 光合色素含量的测定
•       2.2.10.5 过氧化氢含量和超氧阴离子自由基的测定
•       2.2.10.6 DAB和 NBT染色
•       2.2.10.7 抗氧化酶活性的测定
•   2.3 统计分析
• 3 结果与分析
•   3.1 苹果HMGR基因家族表达分析
•   3.2 MdHMGR5 与同源蛋白的聚类分析
•   3.3 MdHMGR5 基因组织表达模式分析
•   3.4 MdHMGR5 基因克隆及过表达载体的构建
•   3.5 MdHMGR5 蛋白亚细胞定位
•   3.6 过表达MdHMGR5 拟南芥的鉴定
•   3.7 过表达MdHMGR5 拟南芥HMGR酶活性的测定
•   3.8 抑制剂对转基因拟南芥种子萌发和根长的影响
•   3.9 转基因拟南芥的抗氧化胁迫能力分析
•     3.9.1 氧化胁迫对转基因拟南芥种子萌发和根长的影响
•     3.9.2 氧化胁迫对转基因拟南芥生长及含水量的影响
•     3.9.3 氧化胁迫对转基因拟南芥HMGR酶活性的影响
•     3.9.4 氧化胁迫对转基因拟南芥光合色素含量的影响
•     3.9.5 氧化胁迫下转基因拟南芥膜脂受伤害程度的分析
•     3.9.6 氧化胁迫对转基因拟南芥活性氧积累的影响
•     3.9.7 氧化胁迫对转基因拟南芥抗氧化酶活性的影响
•     3.9.8 氧化胁迫后拟南芥萜类代谢途径关键酶基因表达分析
• 4 讨论
•   4.1 苹果HMGR基因家族表达模式分析
•   4.2 MdHMGR5 基因组织表达模式分析
•   4.3 过表达MdHMGR5 降低转基因拟南芥对抑制剂的敏感性
•   4.4 过表达MdHMGR5 提高了转基因拟南芥的抗氧化能力
•   4.5 过表达MdHMGR5 影响了拟南芥萜类代谢途径基因的表达
•   4.6 保守基序缺失分析
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张敏

导师: 张元湖

关键词: 苹果,功能分析,抑制剂,氧化胁迫

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,园艺

单位: 山东农业大学

基金: 国家自然科学基金(No. 31370359)

分类号: Q943.2;S661.1

总页数: 70

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