一种抗坏血酸过氧化物酶突变体MaAPX1M36K及其应用论文和设计-段学武

全文摘要

本发明提供了一种抗坏血酸过氧化物酶突变体MaAPX1M36K及其应用，涉及生物技术技术领域。本发明所述突变体MaAPX1M36K的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本发明通过原核表达突变体MaAPX1M36K重构蛋白，通过酶活测定发现突变体MaAPX1M36K催化效率提高了近5倍，可为APX1的进一步研究和应用提供技术参考。

主设计要求

1.一种抗坏血酸过氧化物酶突变体MaAPX1M36K，其特征在于，所述突变体MaAPX1M36K的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。

设计方案

1.一种抗坏血酸过氧化物酶突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>，其特征在于，所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。}}

2. 一种权利要求1所述抗坏血酸过氧化物酶突变体MaAPX1 ^{M36K<\/sup>的基因的构建方法，其特征在于，所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>的基因通过PCR方式获得，所述PCR的引物包括含酶切位点的引物对和含突变位点的引物对；所述含酶切位点的引物对的序列如SEQ ID NO.4～5所示；所述含突变位点的引物对的序列如SEQ ID NO.6～7所示；}}

所述PCR的方法包括：(1)以MaAPX1基因为模板，以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.7所示序列为引物进行PCR，得第一PCR产物；

(2)以MaAPX1基因为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物进行PCR，得第二PCR产物；

(3)以所述第一PCR产物和第二PCR产物为模板，以SEQ ID NO.4～5所示序列为引物进行PCR，得含酶切位点的突变体MaAPX1 ^{M36K<\/sup>的PCR产物；}

步骤(1)和步骤(2)之间不存在时间上的先后顺序；步骤(1)和步骤(2)所述的MaAPX1基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述酶切位点为内切酶nde I的酶切位点。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)～(3)所述PCR的程序，独立的为：94℃预变性4min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min。

5.一种包含权利要求1所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>的基因的重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒的构建方法，包括将所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>的基因与表达载体pET28a(+)连接。}}

6.一种表达权利要求1所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>或权利要求2～4任一项所述的构建方法构建得到的突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>基因或权利要求5所述重组表达质粒的细胞系，其特征在于，所述细胞系以大肠杆菌为宿主表达细胞。}}

7.权利要求1所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>或权利要求2～4任一项所述构建方法构建得到的突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>基因或权利要求5所述重组表达质粒或权利要求6所述细胞系在提高抗坏血酸过氧化物酶酶活中的应用。}}

设计说明书

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种抗坏血酸过氧化物酶突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>及其应用。}

背景技术

活性氧(ROS)作为细胞代谢的副产物，主要包括H_{2<\/sub>O_{2<\/sub>、超氧阴离子以及单线态氧等，在信号转导和稳态中起到重要的作用。然而，在环境胁迫或衰老过程中，ROS过度积累会对蛋白质、DNA、脂质等大分子造成氧化损伤，进而导致结构和功能丧失，甚至可能导致细胞死亡。为了对抗氧化应激，生物进化出复杂的保护系统，如活性氧清除酶和大分子修复系统。}}

植物体中存在超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶以及过氧化物酶等抗氧化物酶体系，另外，还有 VC、谷胱甘肽、生育酚以及酚类化合物等一些低分子量的抗氧化物。其中， APX对H _{2<\/sub>O_{2<\/sub>有较高的亲和性，一般以VC为电子传递体催化H_{2<\/sub>O_{2<\/sub>分解为氧气和水，在叶绿体、线粒体、胞质、过氧化物酶体以及质外体中均起到清除 H _{2<\/sub>O_{2<\/sub>的重要作用。植物中APX的活性受多种翻译后调节，而关于如何提高 APX的活性，并没有相应的报道。}}}}}}

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗坏血酸过氧化物酶突变体 MaAPX1 ^{M36K<\/sup>及其应用，通过对抗坏血酸过氧化物酶活性中心的疏水性改变，使得抗坏血酸过氧化物酶的酶活提高近5倍。}

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种抗坏血酸过氧化物酶突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>，所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。}}

本发明还提供了一种抗坏血酸过氧化物酶突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>基因的构建方法，所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>的基因通过PCR方式获得，所述PCR用引物包括含酶切位点的引物对和含突变位点的引物对；所述含酶切位点的引物对的序列如SEQ ID NO.4～5所示；所述含突变位点的引物对的序列如SEQ ID NO.6～7所示。}}

优选的，所述酶切位点为内切酶nde I的酶切位点。

优选的，所述PCR的方法，包括：(1)以MaAPX1基因为模板，以SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.7所示序列为引物进行PCR，得第一PCR产物；

(2)以MaAPX1基因为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物进行PCR，得第二PCR产物；

(3)以所述第一PCR产物和第二PCR产物为模板，以SEQ ID NO.4～5 所示序列为引物进行PCR，得含酶切位点的突变体MaAPX1 ^{M36K<\/sup>的PCR产物；}

步骤(1)和步骤(2)之间不存在时间上的先后顺序。

优选的，步骤(1)～(3)所述PCR的程序，独立的为：94℃预变性4min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min。

本发明还提供了一种包含所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>的重组表达质粒，所述重组表达质粒的构建方法，包括将所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>的基因与表达载体pET28a(+)连接。}}

本发明还提供了一种表达所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>或所述构建方法构建得到的突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>基因或所述重组表达质粒的细胞系，所述细胞系以大肠杆菌为宿主表达细胞。}}

本发明还提供了所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>或所述构建方法构建得到的突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>基因或所述重组表达质粒或所述细胞系在提高抗坏血酸过氧化物酶酶活中的应用。}}

本发明提供了一种抗坏血酸过氧化物酶突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>，所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明所述突变体 MaAPX1 ^{M36K<\/sup>是对序列如ESQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行定点突变，将第36位的Met突变成Lys，从而提高抗坏血酸过氧化物酶的活性。本发明所得到的抗坏血酸过氧化物酶突变体MaAPX1 ^{M36K<\/sup>可以作为一种可以显著提高酶催化活力的突变体材料为APX的进一步研究提供参考。}}}}

附图说明

图1为本发明实施例中分光光度法测定酶活对比图；

图2为本发明实施例中活性染色法测定蛋白活性对比图。

具体实施方式

本发明提供了一种抗坏血酸过氧化物酶突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>，所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明所述突变体 MaAPX1 ^{M36K<\/sup>优选是将MaAPX1氨基酸序列中第36位的Met突变成Lys；所述MaAPX1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明对所述突变的方法并没有具体限定，优选为点突变。本发明所述MaAPX1优选来源于香蕉，基因序列如SEQ ID NO.1所示，共750个碱基序列，基因编码的蛋白中含有 249个氨基酸，在香蕉基因组中对应的基因号是GSMUA_Achr5T07280_001。}}}

本发明所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>的基因优选通过PCR方式获得，所述 PCR用引物包括含酶切位点的引物对和含突变位点的引物对，具体如表1所示：}

表1克隆MaAPX1基因所需引物

表1中含突变位点引物序列划下划线部分为突变位点。

本发明所述酶切位点优选为内切酶nde I的酶切位点。

本发明利用上述引物进行突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>的基因的PCR克隆，所述PCR的方法，优选包括：(1)以MaAPX1基因为模板，以SEQ ID NO.4 和SEQ ID NO.7所示序列为引物进行PCR，得第一PCR产物；}

(2)以MaAPX1基因为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物进行PCR，得第二PCR产物；

(3)以所述第一PCR产物和第二PCR产物为模板，以SEQ ID NO.4～5 所示序列为引物进行PCR，得含酶切位点的突变体MaAPX1 ^{M36K<\/sup>的PCR产物；}

步骤(1)和步骤(2)之间不存在时间上的先后顺序。

本发明所述PCR方法中，步骤(1)～(3)所述PCR的程序，独立的为：94℃预变性4min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min。本发明对所述PCR的体系并没有特殊限定，利用本领域的常规PCR体系即可。

本发明得到所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>的基因后，优选还包括进行电泳检测，所述电泳检测的方法并没有特殊限定，利用常规的琼脂糖凝胶电泳方法即可。}

本发明将得到的所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>的基因与表达载体pET28a(+) 连接，本发明所述连接选用的反应体系为In-fusion反应体系(TaKaRa)优选：Purified RCRfragment，100ng；Linearized vector：200ng；5×In-Fusion HD Enzyme Premix，2μL，根据上述体积加Deionized water至10μL。对应的负对照：Linearized vector：1μL；5×In-Fusion HD Enzyme Premix，2μl； Deionized water，7μL。pUC19阳性对照：Purified RCRfragment，2μL of 2kb control insert；Linearized vector：1μL of pUC19controlvector；5×In-Fusion HD Enzyme Premix，2μL；Deionized water：5μL。本发明所述连接的程序优选：将以上反应体系轻轻混匀后放置于50℃孵育15min，然后置于冰上，即得连接产物，可进行下一步转化或将连接产物储存于-20℃备用。}

本发明还提供了一种表达所述突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>或所述构建方法构建得到的突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>基因或所述重组表达质粒的细胞系，所述细胞系以大肠杆菌为宿主表达细胞。本发明所述细胞系是以pET28a(+)为载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，表达突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>。本发明所述细胞系的获得方法，优选包括：将所述重组表达质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在700μL LB培养基中培养1h(37℃，200rpm)，取400μL菌液涂布于含卡那霉素的固体LB平板，37℃过夜培养，挑取阳性菌落PCR鉴定，并进行测序鉴定，将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，通过PCR鉴定阳性菌液按1:1加入50％灭菌甘油低温(-80℃)保存，即得所述细胞系。本发明对所述测序鉴定并没有特殊限定，优选通过生物公司进行，在本发明实施例中，由广州艾基测序公司进行所述测序工作。本发明所述LB液体培养基的成分包括：蛋白胨10g\/L、酵母粉5g\/L、氯化钠10g\/L， pH7.0；所述LB固体培养基的成分包括蛋白胨10g\/L、酵母粉5g\/L、氯化钠 10g\/L、1.5％琼脂粉，pH7.0。}}}

下面结合实施例对本发明提供的抗坏血酸过氧化物酶突变体 MaAPX1 ^{M36K<\/sup>及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。}

实施例1

1、采样：所选用的香蕉(芭蕉科芭蕉属植物)品种是巴西蕉，采自广东省南沙市。

2、MaAPX1基因的克隆

通过常规的热硼酸法对香蕉果皮中总RNA进行提取，将提取的总RNA 按照试剂盒PrimeScript ^{TM<\/sup> RT Master Mix(Perfect Real Time，RR036A， TaKaRa)提供的方法将RNA反转录成cDNA，反应体系：XμLRNA(<500 ng)、2μL 5×Mix、YμLRNase Free water混匀，使总体积为10μL，然后放在37℃恒温水浴锅中水浴15min，85℃金属浴热激5s，4℃冷却即可。}

3、MaAPX1表达菌株的构建

根据香蕉基因组(Banana Genome Hub)中MaAPX1基因序列设计含nde I酶切位点的引物以及突变位点的引物，引物序列如表1所示；

先分别用含酶切位点的上游引物与突变位点的下游引物进行PCR得到产物1，然后用突变位点的上游引物与酶切位点的下游引物进行PCR得到产物2，然后以产物1和产物2为模板，以含酶切位点的上下游引物进行PCR 得到含酶切位点的突变体MaAPX1 ^{M36K<\/sup> PCR产物。PCR条件为：94℃预变性4min，然后进行35个循环(94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸90s)， 72℃延伸10min。PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测。}

将MaAPX1^{M36K<\/sup>的PCR产物回收，与pET28a(+)载体连接构建重组表达质粒，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在700μL LB培养基中培养1h (37℃，200rpm)，取400μL菌液涂布于含卡那霉素的固体LB平板，37℃过夜培养，挑取阳性菌落PCR鉴定，并将阳性菌液送广州艾基测序公司进行测序。}

将公司返回测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，通过PCR鉴定阳性菌液按1:1加入50％灭菌甘油低温(-80℃)保存。

4.MaAPX1和MaAPX1^{M36K<\/sup>的原核表达和纯化}

(1)原核表达

将菌种进行扩大培养(37℃，200rpm)，当菌液浓度达到OD_{600<\/sub>为0.4-0.6 时，将菌液降温至16℃后加入终浓度为1mM的蛋白诱导剂IPTG进行低温诱导(16℃，100rpm)，培养20～24h后收集菌体。}

(2)蛋白纯化

先加入无菌水将菌体悬浮，4℃6000g离心8min除去培养基，然后加入适量体积的蛋白提取液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 7.5)将菌体悬浮，根据菌液体积按1：1000加入Triton-100以提高蛋白的提取效率。充分悬浮菌体后，利用低温超高压连续流细胞破碎机将菌体破碎1h(超声30s，停30s)，超声期间要将盛有菌液的容器要保持充分冰浴，以免超声过程中探头发热导致蛋白活性降低。超声破碎完毕后加入终浓度为1mM的PMSF抑制蛋白降解。4℃9000g离心30min，将上清液过膜(0.45μm)，然后将已用蛋白提取液平衡好的Ni-NTASuperflow Cartridges(QIAGEN)加入到蛋白溶液中，最后加入终浓度为10mM的咪唑，于4℃低温使蛋白与填料旋转结合 2h以上。

先将静置后的蛋白上清液流过镍柱，最后将填料也一并转移到镍柱中，当上清液全部流过镍柱后，加入40mM咪唑(含20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 7.5)洗杂蛋白，直至流下的溶液用考马斯亮蓝G250(碧云天) 检测无蛋白为止。然后用250mM咪唑(含20mM Tris-HCl，500mM NaCl， pH 7.5)洗脱目标蛋白。由于咪唑对蛋白活性有影响，因此要及时将收集的目标蛋白液用50mM pH7的磷酸钾缓冲液通过Sephadex G-25脱盐柱(GE) 离心(4℃，3800g)将蛋白中咪唑置换掉。最后将纯化后的目标蛋白保存在 -80℃超低温冰箱，留取部分纯化好的蛋白与未纯化的蛋白进行跑胶检测。

5.采用分光光度法和活性染色法测定MaAPX1及其突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>的活性，方法如下：}

分光光度法

将纯化的蛋白里的洗脱液通过脱盐柱置换为50mM pH7.0的磷酸钾缓冲液(含0.1mM EDTA-Na2)。活性测定的具体方法如下：

(1)将蛋白稀释成一定浓度后，根据BCA试剂盒(碧云天)的说明书用酶标仪测定蛋白浓度。

(2)测定时将紫外分光光度计的波长设为290nm，选用1mL石英比色皿，用50mMpH7.0的磷酸钾缓冲液(含0.1mM EDTA-Na _{2<\/sub>)做对照。先向比色皿中加入500μL蛋白溶液，然后加入250μL 1mM VC(50mM pH7.0的磷酸钾缓冲液，0.1mM EDTA-Na _{2<\/sub>)混匀后放入槽中，最后加入250μL 0.12M H _{2<\/sub>O_{2<\/sub>启发反应，记录2min内OD值的变化，每15s记录一次读数，以室温下每分钟氧化1μM VC的酶量为一个酶活性单位U。每个实验重复3次以上。}}}}

蛋白活性的计算方法如下

APX活性U＝(ΔOD×1000×1000)\/(t×c×v×2.8)

公式中ΔOD：吸光度值的变化；

1000：将mL转换成μL；

1000：将mmol转换成μmol；

t：时间，min；

c：蛋白浓度，mol\/L；

v：蛋白体积，mL；

2.8：吸光系数，mmol\/L cm。

测定结果如图1所示，其中MaAPX1的酶活为(335.85±0.52)U\/μg，突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>的酶活为(1522.11±22.9)U\/μg。}

活性染色法

具体步骤如下：

(1)非变性胶

分离胶(10％，15mL)配方如表2所示：

表2分离胶配方

浓缩胶(4mL)配方如表3所示：

表3浓缩胶配方

(2)电泳液(1L)配方如表4所示：

表4电泳液配方

变性胶的配置及电泳液的配置按照TaKaRa配方配制即可。

(3)5×loading buffer

非变性5×loading buffer配方如表5所示：

表5非变性5×loading buffer配方

变性5×loading buffer配方如表6所示：

表6变性5×loading buffer配方

(4)用BCA法测定蛋白浓度后，对蛋白进行定量，用50mM pH7.0的磷酸钾缓冲液补足体积。准备两份蛋白样品分别跑变性胶和非变性胶，变性胶用于蛋白检测蛋白纯化的效果并检测定量是否准确，非变性胶用于后续活性染色实验，分别加上相应的loadingbuffer。跑变性胶的样品需煮沸10min 将蛋白变性，然后25℃12000rpm离心10min后上样。用于跑非变性胶的蛋白样品不需煮沸，可直接上样跑胶。非变性胶电泳过程中要将电泳槽放入4℃冰箱中保持低温电泳以防止蛋白样品在电泳过程中因电泳液温度升高而发生变性，且要注意避光。电泳条件：恒压100V跑完浓缩胶，然后将电压调至120V跑分离胶。

(5)电泳结束后，将变性胶浸入考马斯亮蓝染色液中染色4-5h，然后脱色并拍照。将非变性胶用灭菌的去离子水清洗一次。然后放入50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0，含终浓度为2mM VC)中平衡凝胶30min(每10min更换溶液，共3次，可缓慢摇动，始终保持溶液浸没蛋白凝胶)。

(6)倒掉平衡液，加入100mL催化液(50mM磷酸钾缓冲液pH7.0，含终浓度4mM的VC和3mM的H_{2<\/sub>O_{2<\/sub>)将蛋白胶浸泡30min进行酶催化反应(可缓慢摇动，始终保持溶液浸没蛋白凝胶)。}}

(7)倒掉催化液，再用50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)冲洗1min。

(8)最后将蛋白凝胶放入100mL显色液(50mM磷酸钾缓冲液pH7.8，含终浓度28mMTEMED以及2.45mM NBT)中缓慢摇动(溶液一直要浸没蛋白凝胶)进行显色反应，10-20min可根据显色情况终止反应(立即倒掉显色液，用灭菌的去离子水清洗)，对凝胶立即拍照。

(9)自第(5)步开始始终保持黑暗条件下进行试验,结果如图2所示。

本发明提供了一种抗坏血酸过氧化物酶突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>及其应用，通过原核表达突变体MaAPX1^{M36K<\/sup>重构蛋白，通过酶活测定发现突变体 MaAPX1 ^{M36K<\/sup>催化效率提高了近5倍，可为APX1的进一步研究提供技术参考。}}}

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院华南植物园

<120> 一种抗坏血酸过氧化物酶突变体MaAPX1 ^{M36K<\/sup>及其应用}

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 750

<212> DNA

<213> Musa acuminata Lour.

<400> 1

atggcgaagt cgtatccgac ggtgagtgag gagtaccaga aggcggtaga gaaggccaag 60

aggaagctcc gtggcctcat cgccgagaag aactgtgccc cgttgatgct ccggctcgcg 120

tggcactcgg cgggtacgta cgatgtggtg tcaaagacgg gcggtccgtt cgggaccatg 180

aggttccctg cggagctcgc ccacggcgcc aacaacgggc tcaacatcgc tgtcaggctc 240

ttggagccca tcaaggagca gttccccatc ttgacatacg ctgacttcta tcagctcgcc 300

ggagttgtgg ctgtcgaagt taccggagga ccggagatcc ctttccatcc tgggagggag 360

gacaagcctg aacctcccgt agaaggtcgc cttcctgatg ctaccaaggg ttctgatcac 420

cttagggatg tgtttggtca catgggtctc agcgatcagg atatcgttgc attatctggt 480

ggacacacac tgggaaggtg ccacaaggag cgatctggtt ttgagggggc ttggacttcc 540

aatcctctta tttttgacaa ctcatacttc aaggaactcc tgagtggaga gaaagaagac 600

cttctccagc tgccttctga caaggccctt ctaactgatc ctgtattccg ccctcttgtg 660

gagaaatatg ctgccgatga ggatgccttc tttgctgatt acactgaagc tcacctgaag 720

ctctcagaac tcggatttgc tgaggcttaa 750

<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<213> Musa acuminata Lour.

<400> 2

Met Ala Lys Ser Tyr Pro Thr Val Ser Glu Glu Tyr Gln Lys Ala Val

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Arg Lys Leu Arg Gly Leu Ile Ala Glu Lys Asn Cys

20 25 30

Ala Pro Leu Met Leu Arg Leu Ala Trp His Ser Ala Gly Thr Tyr Asp

35 40 45

Val Val Ser Lys Thr Gly Gly Pro Phe Gly Thr Met Arg Phe Pro Ala

50 55 60

Glu Leu Ala His Gly Ala Asn Asn Gly Leu Asn Ile Ala Val Arg Leu

65 70 75 80

Leu Glu Pro Ile Lys Glu Gln Phe Pro Ile Leu Thr Tyr Ala Asp Phe

85 90 95

Tyr Gln Leu Ala Gly Val Val Ala Val Glu Val Thr Gly Gly Pro Glu

100 105 110

Ile Pro Phe His Pro Gly Arg Glu Asp Lys Pro Glu Pro Pro Val Glu

115 120 125

Gly Arg Leu Pro Asp Ala Thr Lys Gly Ser Asp His Leu Arg Asp Val

130 135 140

Phe Gly His Met Gly Leu Ser Asp Gln Asp Ile Val Ala Leu Ser Gly

145 150 155 160

Gly His Thr Leu Gly Arg Cys His Lys Glu Arg Ser Gly Phe Glu Gly

165 170 175

Ala Trp Thr Ser Asn Pro Leu Ile Phe Asp Asn Ser Tyr Phe Lys Glu

180 185 190

Leu Leu Ser Gly Glu Lys Glu Asp Leu Leu Gln Leu Pro Ser Asp Lys

195 200 205

Ala Leu Leu Thr Asp Pro Val Phe Arg Pro Leu Val Glu Lys Tyr Ala

210 215 220

Ala Asp Glu Asp Ala Phe Phe Ala Asp Tyr Thr Glu Ala His Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Glu Leu Gly Phe Ala Glu Ala

245

<210> 3

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Lys Ser Tyr Pro Thr Val Ser Glu Glu Tyr Gln Lys Ala Val

1 5 10 15

Glu Lys Ala Lys Arg Lys Leu Arg Gly Leu Ile Ala Glu Lys Asn Cys

20 25 30

Ala Pro Leu Lys Leu Arg Leu Ala Trp His Ser Ala Gly Thr Tyr Asp

35 40 45

Val Val Ser Lys Thr Gly Gly Pro Phe Gly Thr Met Arg Phe Pro Ala

50 55 60

Glu Leu Ala His Gly Ala Asn Asn Gly Leu Asn Ile Ala Val Arg Leu

65 70 75 80

Leu Glu Pro Ile Lys Glu Gln Phe Pro Ile Leu Thr Tyr Ala Asp Phe

85 90 95

Tyr Gln Leu Ala Gly Val Val Ala Val Glu Val Thr Gly Gly Pro Glu

100 105 110

Ile Pro Phe His Pro Gly Arg Glu Asp Lys Pro Glu Pro Pro Val Glu

115 120 125

Gly Arg Leu Pro Asp Ala Thr Lys Gly Ser Asp His Leu Arg Asp Val

130 135 140

Phe Gly His Met Gly Leu Ser Asp Gln Asp Ile Val Ala Leu Ser Gly

145 150 155 160

Gly His Thr Leu Gly Arg Cys His Lys Glu Arg Ser Gly Phe Glu Gly

165 170 175

Ala Trp Thr Ser Asn Pro Leu Ile Phe Asp Asn Ser Tyr Phe Lys Glu

180 185 190

Leu Leu Ser Gly Glu Lys Glu Asp Leu Leu Gln Leu Pro Ser Asp Lys

195 200 205

Ala Leu Leu Thr Asp Pro Val Phe Arg Pro Leu Val Glu Lys Tyr Ala

210 215 220

Ala Asp Glu Asp Ala Phe Phe Ala Asp Tyr Thr Glu Ala His Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Glu Leu Gly Phe Ala Glu Ala

245

<210> 4

<211> 40

<212> DNA\/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgcgcggca gccatatggc gaagtcgtat ccgacggtga 40

<210> 5

<211> 43

<212> DNA\/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtcatgcta gccatatgtt aagcctcagc aaatccgagt tct 43

<210> 6

<211> 27

<212> DNA\/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aactgtgccc cgttgaagct ccggctc 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA\/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagccggagc ttcaacgggg cacagtt 27

设计图

一种抗坏血酸过氧化物酶突变体MaAPX1M36K及其应用论文和设计

一种抗坏血酸过氧化物酶突变体MaAPX1M36K及其应用论文和设计-段学武

全文摘要

主设计要求

设计方案

设计说明书

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