包头医学院医学技术学院内蒙古包头014030
摘要：【目的】从食源中筛选具有抑菌活性的蜡样芽孢杆菌，为新抗菌肽的发现及其开发利用提供基础资料；【方法】先用甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基（MYP）和蜡样芽孢杆菌杆菌显色培养基（HKM）相继初筛蜡样芽孢杆菌，再测定抑菌活性，之后对筛选菌株进行系统生化鉴定及生化分型；【结果】从食源中筛选出六株具有抑菌活性（对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌生长具有抑制作用）、革兰阳性芽孢杆菌，应用系统生化鉴定为蜡样芽孢杆菌，生化分型为11型。【结论】从食源中分离得到六株具有抑菌活性的蜡样芽孢杆菌，可进一步分子鉴定并研究其抑菌谱和抑菌物质的特性等。
关键词：食源；抑菌活性；蜡样芽孢杆菌；分离；生化鉴定
Abstract：【Objective】screeningofBacilluscereuswithantibacterialactivityfromfoodsource，fornewantimicrobialpeptidesfoundanditsexploitationandutilizationtoprovidebasicinformation；【method】firstwithmannitolyolkpolymyxinagar（MYP）andBacilluscereusBacilluschromogenicmedium（HKM）havebeenthebeginningofscreeningofBacilluscereus，determinationofantibacterialactivity，afterthescreeningofstrainsforsystemofbiochemicalidentificationandbiochemicaltyping；【results】screenedsixstrainswithantimicrobialactivity（hasinhibitoryeffectonEscherichiacoli、Staphylococcusaureusgrowth）fromfoodsource，grampositivebacillus，biochemicalidentificationapplicationsystemforBacilluscereus，biochemicaltypingfortypeeleven.【Conclusion】sixstrainsofantagonisticactivityofBacilluscereusisolatedfromfoodborne，furthermolecularidentificationandstudyofitsantibacterialspectrumandantibacterialpropertiesofamaterialetc..
Keywords：foodsourceantifungalactivityBacilluscereusisolationbiochemicalidentification
蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus，Bc）分布广泛，灰尘、污水、植物性食品和许多生熟食品中常见；是一种好氧性、但在厌氧情况下也可很好生长的革兰阳性芽孢杆菌[1]。目前蜡样芽孢杆菌杆菌多应用于微生态制剂来应对人和动物肠道微生态系统失调、免疫力下降、抗生素药物残留及产生抗药性等问题。蜡样芽孢杆菌类制剂大多为非消化性药剂或食品添加剂，能选择性促进生活在肠道的微生物的活性，同时抑制肠道内有害病菌的生长，降低宿主染病的机会，使宿主保证健康。显然这些应用中包涵了蜡样芽孢杆菌杆菌的“抑菌”作用，而于目前蜡样芽孢杆菌的抑菌作用及其抑菌物质的研究并不多见和深入，因此，本课题旨在从食源中筛选具有广谱抑菌活性的蜡样芽孢杆菌，为新抗菌物质——抗菌肽的发现及其开发利用提供基础资料。本论文阐述了从食源中筛选并鉴定的具有抑菌活性的蜡样芽孢杆菌的实验内容。
1材料与方法
1.1食源：牛奶、凉拌菜、果酱、大米饭、粥、家常炒菜（土豆、木耳、肉片）和炖菜等等，室温放置3天后分离细菌。
1.2培养基：普通营养琼脂平板，甘露醇卵黄多粘菌素琼脂平板（MYP），蜡样芽孢杆菌显色培养基（HKM），酪蛋白琼脂，血琼脂平板，淀粉水解琼脂培养基、半固体培养基，木糖、葡萄糖、甘露醇、葡萄糖蛋白胨、柠檬酸盐、明胶及硝酸盐还原、产气微量生化管等，甲基红、VP试剂、硝酸盐还原试剂和革兰染液等。
1.3指示菌：大肠埃希菌ATCC35218、金黄色葡萄球菌ATCC26113、金黄色葡萄球菌ATCC25923（标准菌株购至杭州天和微生物制品有限责任公司）和铜绿假单胞菌（本实验室保存菌种）。
1.4初步筛选蜡样芽孢杆菌：将各种食材无菌研磨后用无菌生理盐水稀释成10-1~10-5，用灭菌L型玻璃棒涂布接种于HKM平板，35℃培养24h后查找蓝绿色，带有白色浑浊环的蜡滴状菌落转接到MYP平板，选择粉红色并带有粉红色晕的蜡滴状菌落，经革兰染色镜检为革兰阳性芽孢杆菌，两端钝圆、芽孢位于菌体中央或偏于一端，不大于菌体；符合以上特征即可作为蜡样芽孢杆菌杆菌的初筛菌株。
1.5初筛菌株抑菌活性的测定：将初筛菌株，检测其对具体做法：将指示菌株用无菌生理盐水调制成0.5麦氏浊度的菌悬液，用灭菌棉签涂布于普通营养琼脂平板表面，之后将初筛菌株划“Z”字形接种上去，35℃培养24h，观察有无抑菌现象，筛查出具有抑菌活性的菌株，并命名编号。
1.6编号菌株系统的生化鉴定：将编号菌株纯培养于普通营养琼脂平板，35℃培养24h，观察具有蜡样光泽、蜡滴状的特征菌落；特征菌落再经革兰染色镜检为革兰阳性芽孢杆菌；全面生化鉴定试验：触酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白水解试验、卵黄反应、甘露醇反应、木糖反应、葡萄糖氧化发酵试验、溶血试验、甲基红试验、氧化酶试验；另外蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌在生化性状上极为相似，采用伴孢晶体蛋白检测试验加以鉴别；蜡样芽孢杆菌生化分型鉴定：柠檬酸盐利用试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、VP试验、明胶液化试验[2]。
2结果与分析
2.1初步筛选蜡样芽孢杆菌试验结果：获得蜡样芽孢杆菌初筛菌株11株，均为革兰阳性芽孢杆菌，在HKM琼脂平板上长出蓝绿色、周围有白色浑浊环的蜡滴状菌落（见图1），在MYP平板上生长出粉红色、周围有粉红色晕的蜡滴状菌落（见图2）。
2.2初筛菌株抑菌活性的测定结果：初筛菌株对指示菌（大肠埃希菌ATCC35218、金黄色葡萄球菌ATCC26113、ATCC25923或铜绿假单胞菌）有抑菌活性的菌株有六株，分别命名编号为BC1、BC2、BC3、BC4、BC5、BC6，抑菌现象表现为在“Z”字周围出现透明抑菌区域（见图3），六株菌对指示菌的抑菌情况建表1。
注：表中“+”代表有抑菌活性，“-”代表有无抑菌活性
2.3编号菌株系统的生化鉴定结果：
六株初筛菌株革兰染色、培养特征、生化鉴定及分型均一致。革兰染色镜下均呈现菌体粗大、两端钝圆、中央或偏于一端有芽孢的革兰阳性芽孢杆菌（见图4）；在普通营养琼脂平板上均出现灰白色蜡滴状，有蜡样光泽的菌落；全面生化鉴定试验结果为：动力试验、触酶试验、酪蛋白水解试验、卵黄反应、溶血试验、甲基红试验均呈阳性，氧化酶试验、伴孢晶体蛋白检测呈阴性，不分解甘露醇和木糖的发酵型细菌，这些均符合蜡样芽孢杆菌的生化特征；综合上述实验结果，6株编号菌株可鉴定为蜡样芽孢杆菌。
六株蜡样芽孢杆菌生化分型试验结果一致，柠檬酸盐利用试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、明胶液化试验呈阳性，VP试验呈阴性，均鉴定为蜡样芽孢杆菌11型[2]。
（Antibacterialphenomenonofscreeningstrains）
（GramstainEndoscopicmorphologyofscreeningstrains）
3讨论
蜡样芽孢杆菌是常见的食品污染菌，本实验旨在从食源中分离到具有抑菌活性的蜡样芽孢杆菌。实验过程是先用蜡样芽孢杆菌的两种选择鉴别培养基MYP和HKM相继分离培养食材中的蜡样芽孢杆菌，选择二者都具有蜡样芽孢杆菌典型菌落特征的细菌进行抑菌性的初步筛选，之后再经过系统的生理生化鉴定试验，鉴定结果为六株具有抑菌活性的蜡样芽孢杆菌，命名为BC1、BC2…BC6，而且通过五个生化分型试验可将此六株菌归为蜡样芽孢杆菌11型。六株菌后经16SrDNA分子基因序列分析[3-4]，也进一步确定与蜡样芽孢杆菌的同源性达99%-100%。这种筛选蜡样芽孢杆菌的方法和思路通过本实验证实是可行的，也是本实验的创新点。本实验表明联合应用MYP和HKM培养基筛选蜡样芽孢杆菌的准确率很高，也证实了文献[5]报道的MYP及PEMBA培养基（组分同HKM）对蜡样芽孢杆菌有良好的选择性。
蜡样芽孢杆菌为革兰阳性大杆菌，兼性需氧，菌体两端钝圆，芽孢不突出于菌体，位于中央或偏于一侧；动力阳性，触酶阳性，能分解酪蛋白，硝酸盐还原试验阳性，卵黄反应呈阳性，能溶血，有氧无氧都可利用葡萄糖，不分解甘露醇、木糖。与蜡样芽孢杆菌在生化性状和菌落特征上极其相似的细菌首先是苏云金芽孢杆菌，其次是蕈状芽孢杆菌，必须通过专门的鉴别试验才能与二者区分开[6]。与苏云金芽孢杆菌专用鉴别试验是伴孢晶体蛋白检测试验，用此方法可以检测到苏云金芽孢杆菌有红色菱形的蛋白晶体，而蜡样芽孢杆菌没有，本实验中分离到的六株菌伴孢晶体蛋白检测试验均呈阳性。与蕈状芽孢杆菌的鉴别试验为根状试验，根状试验是用接种针挑取单个菌落划线接种于普通营养琼脂平板上，培养后可观察到蕈状芽孢杆菌呈发散似树根状生长，蜡样芽抱杆菌呈毛玻璃或融蜡状生长；本实验分离到的六株菌在普通营养琼脂平板上呈毛玻璃或融蜡状生长。
本实验对于抑菌活性的初步测定方法比较粗陋，后期研究采用比较标准的打孔扩散法测定抑菌活性及抑菌谱。筛选出的六株菌中多数菌株对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌、大肠埃希菌等有抑制作用。也有文献[7]报道蜡样芽孢杆菌对大肠埃希菌有抑制作用，表明在健康动物肠道或体表，蜡样芽孢杆菌在维持微生态平衡、抵抗病原菌感染方面，具有重要的生态学意义。近几年国外的国外文献[8-12]也有报道蜡样芽孢杆菌具有抑菌活性。有报道所产抑菌物质为是环肽类，属于抗菌肽，具有研发、开发和利用价值。
参考文献：
[1]MORRISJRJG．Bacilluscereusfoodpoisoning[J].ArchInterMed．1981．141（6）：711
[2]中华人民共和国国家标准《食品卫生微生物学检验》[M].2004-01-01，95-100
[3]LechnerS，MayrR，FrancisKP，etal．BacillusweihenstephanesisspnovisanewpsychrotolerantspeciesoftheBacilluscereusgroup[J].IntJSystBacterio，1998，48：1373-1382
[4]NakamuraLK．Bacilluspseudomycoidesspnov［J］．IntJSystBacteriol，1998，48：1031-1035
[5]周帼萍，胡晓敏，窦建琳，等．2种蜡样芽孢杆菌群微生物的选择性培养基比较[J]．武汉工业学院学报，2009，28（4）：15-20
[6]侯雨文，韩春艳．蜡样芽孢杆菌对大肠杆菌的体外抑制研究［J］．河南畜牧兽医（综合版），2007，28（4），10-11
[7]罗军.蜡样芽孢杆菌与类似菌鉴别方法研究[J].北方药学，2013，10（8）：4
[8]KumarSN，MohandasC，NambisanB.anewantibacterialandantitumourdiketopiperazinefromBacilluscereusassociatedwitharhabditidentomopathogenic[J].FoliaMicrobiologica，2014，59（3）：197-202.
[9]SunkarS，NachiyarCV.BiogenesisofantibacterialsilvernanoparticlesusingtheendophyticbacteriumBacilluscereusisolatedfromGarciniaxanthochymus[J].AsianPacificJournalOfTropicalBiomedicine，2012，2（12）：953-955.
[10]TanYenNee，MatthewsKarlR，DiRong，etal.Comparativeantibacterialmodeofactionofpurifiedalcalase-andtryptic-hydrolyzedpalmkernelcakeproteinsonthefood-bornepathogenBacilluscereus[J].FoodControl，2013，31（1）：53-58.
[11]LeeNK，YeoIC，ParkJW，atal.Growthinhibitionandinductionofstressprotein，GroEL，ofBacilluscereusexposedtoantibacterialpeptideisolatedfromBacillussubtilisSC-8[J].AppliedBiochemistryAndBiotechnology，2011，165（1）：235-242.
[12]BanerjeeD，ChatterjeeS，BanerjeeUC.GreenpigmentfromBacilluscereusM（1）（16）（MTCC5521）productionparametersandantibacterialactivity[J]，AppliedBiochemistryAndBiotechnology，2011，164（6）：767-779.
作者简介：张美英，1978，女（汉族），内蒙古呼和浩特人，副教授，硕士，从事微生物与免疫学检验教学与研究工作；
基金项目：内蒙古自然基金项目（2012MS1144）