非受体酪氨酸激酶c-Abl和Arg通过磷酸化IRF3调控IFN-β的表达

论文摘要

病原体的先天免疫应答对宿主实施防御应答很重要。通过模式识别受体（PPRs）识别病原体相关分子模式（PAMPs）,宿主感应病毒和细菌病原体的入侵。干扰素调节因子3（IRF3）是针对DNA病毒和RNA病毒感染免疫应答的I型干扰素依赖的关键转录调节因子。IRF3在非感染细胞中定位于细胞质中,病毒感染后转移到细胞核中。病毒感染后,IRF3 C端385位、386位、396位、402位、403位丝氨酸和404位苏氨酸发生磷酸化,丝氨酸磷酸化对IRF3激活并调控IFN-β表达非常重要。通过与其他蛋白发生相互作用,非受体酪氨酸激酶c-Abl参与调控骨架重塑、细胞黏附、细胞增殖、氧化和DNA损伤应激、自噬、细胞转化、细胞凋亡以及细胞迁移等,c-Abl也能调控胸腺细胞的分化,促进脂肪细胞的分化。非受体酪氨酸激酶c-Abl在T细胞发育和免疫应答中也发挥重要作用。然而,人们对c-Abl在先天免疫中的功能了解得还不多。本文目的在于研究c-Abl在先天免疫调控中的作用及机理。实验室前期研究结果表明,c-Abl可以调控多个I型干扰素应答基因的表达,提示c-Abl可能与IRF3相互作用并调节其活性。用抗c-Abl抗体的免疫共沉淀实验发现体内c-Abl与IRF3相互作用。过表达相关蛋白,通过免疫共沉淀本研究也证明了IRF3与c-Abl之间的相互作用。通过Far western实验证明,IRF3与c-Abl可在体外直接结合。通过GST pull down分析,发现c-Abl的SH2和SH3结构域都能与IRF3相互作用,并且SH2结构域与IRF3的相互作用更强,这表明IRF3可能是c-Abl酪氨酸激酶的底物,可以被c-Abl高效磷酸化。利用酪氨酸磷酸化特异的抗体的免疫印迹实验结果证实IRF3能被c-Abl和Abl相关蛋白（Arg）磷酸化。通过LC-MS/MS发现c-Abl主要使IRF3的Y292磷酸化。同时IRF3上还存在着其他未被发现的酪氨酸磷酸化位点,这需要进一步的研究。双荧光素酶报告基因分析发现,当将Y292突变为F时,IRF3介导的IFN-β的转录水平显著降低。通过实时荧光定量PCR,证实c-Abl调控AIM2炎症小体刺激因子poly（dA:dT）诱导的aim2基因的转录,添加Abl抑制剂AMN107后,aim2基因的转录水平显著降低,这表明c-Abl可能在AIM2炎症小体激活中发挥重要作用。同时c-Abl也调控dsDNA、病毒DNA和弗朗西斯菌疫苗株（Ft LVS）激活的AIM2炎症小体的激活,添加Abl抑制剂AMN107后,这些刺激因子激活的炎症小体活性显著降低。体内实验发现,相比较于阴性对照siRNA处理小鼠,c-Abl/Arg siRNA处理小鼠的死亡率显著增高,c-Abl/Arg siRNA处理小鼠脾脏组织中IFN-β和AIM2基因的转录水平被下调,c-Abl/Arg siRNA处理小鼠血清中IL-18水平显著下调。本研究也用Ft LVS感染了经AMN107处理的小鼠或者不处理的小鼠。结果发现,相比较于未处理组,AMN107处理小鼠死亡率也更高,AMN107处理小鼠脾脏组织中IFN-β和AIM2基因的转录水平和caspase-1 p20水平被下调,AMN107处理小鼠血清中IL-18水平显著下调。本研究首次发现IRF3可以发生酪氨酸磷酸化;导致IRF3酪氨酸磷酸化的激酶是c-Abl和Arg,并发现IRF3的Y292是c-Abl调控IRF3激活的一个重要的磷酸化位点。通过调控IFN-β的表达,c-Abl和Arg调控Ft LVS诱导的AIM2炎症小体的激活。本文的研究提供了一个新的关于c-Abl和Arg在调控先天免疫和炎症小体激活中的功能的方向。

论文目录

• 缩略语表
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 质粒及细胞
•     1.1.2 分子生物学试剂
•     1.1.3 抗体
•     1.1.4 主要实验仪器设备
•   1.2 实验方法
•     1.2.1 重组质粒的构建
•     1.2.2 细胞复苏、传代和冻存
•     1.2.3 细胞的转染
•     1.2.4 免疫沉淀以及免疫印迹
•     1.2.5 免疫荧光
•     1.2.6 荧光素酶活性测定
•     1.2.7 ELISA实验测定细胞上清液中目的蛋白的浓度
•     1.2.8 ELISA实验测定小鼠血清中IL-18的浓度
•     1.2.9 RNA提取及反转录反应实验
•     1.2.10 荧光定量PCR
•     1.2.11 细胞刺激
•     1.2.12 Far-Western实验
•     1.2.13 c-Abl/Arg siRNA干扰实验
•     1.2.14 分离小鼠骨髓源巨噬细胞（BMDM）
•     1.2.15 表达GFP的新城疫鸡瘟病毒（NDV-GFP）感染实验
•     1.2.16 统计学分析
• 第二章 实验结果
•   2.1 c-Abl与IRF3相互作用
•     2.1.1 內源性c-Abl与IRF3相互作用
•     2.1.2 过表达c-Abl与IRF3相互作用
•     2.1.3 c-Abl与IRF3之间的相互作用部分依赖于c-Abl激酶活性
•     2.1.4 细胞内c-Abl与IRF3共定位
•     2.1.5 c-Abl与 IRF3 之间的相互作用是组成型的
•   2.2 c-Abl与IRF3之间的相互作用不依赖于MAVS
•   2.3 c-Abl与TBK1不发生相互作用
•   2.4 c-Abl与IRF3直接结合
•     2.4.1 c-Abl SH2和SH3结构域均与IRF3相互作用
•     2.4.2 c-Abl与IRF3直接结合
•   2.5 IRF3被c-Abl和Arg磷酸化
•   2.6 Y292是IRF3被c-Abl磷酸化的位点
•     2.6.1 Y292是IRF3被c-Abl磷酸化的位点
•     2.6.2 IRF3的Y292突变后IRF3与c-Abl相互作用减弱
•     2.6.3 IRF3的Y292突变后磷酸化水平下降
•     2.6.4 c-Abl调控IRF3 S396磷酸化水平
•   2.7 c-Abl和 Arg介导的磷酸化调控IRF3介导的基因表达
•     2.7.1 c-Abl和 Arg抑制IRF3介导的基因的表达
•     2.7.2 c-Abl调控IFN-β基因的转录
•     2.7.3 c-Abl/Arg siRNA处理后IFN-β蛋白水平下降
•     2.7.4 IRF3的Y292突变后IFN-β基因转录水平下降
•     2.7.5 c-Abl调控其他促炎细胞因子的表达
•   2.8 c-Abl通过促进IFN-β表达抑制病毒复制
•     2.8.1 抑制Abl将抑制SeV介导的IFN-β基因的表达
•     2.8.2 c-Abl促进病毒复制
•   2.9 c-Abl和Arg通过上调AIM2表达调控AIM2炎症小体的激活
•     2.9.1 Abl调控AIM2 炎症小体相关基因的表达
•     2.9.2 Abl激酶调控人细胞中AIM2 炎症小体的激活
•     2.9.3 Abl激酶调控小鼠细胞中AIM2 炎症小体的激活
•   2.10 c-Abl和Arg通过激活AIM2炎症小体拮抗Ft LVS感染
•     2.10.1 选择性抑制c-Abl/Arg后小鼠AIM2炎症小体水平下降
•     2.10.2 c-Abl/Arg siRNA处理后小鼠AIM2炎症小体水平下降
• 第三章 讨论
• 第四章 结论与展望
• 参考文献
• 作者在学期间取得的学术成果
• 主要简历
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 罗凤燕

导师: 赵志虎

关键词: 非受体酪氨酸激酶,先天免疫,炎症小体

来源: 军事科学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 军事科学院

分类号: Q75

总页数: 100

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