革兰氏阴性细菌外膜关键分子对细胞全局调控及聚羟基脂肪酸酯合成效率的影响机制

革兰氏阴性细菌外膜关键分子对细胞全局调控及聚羟基脂肪酸酯合成效率的影响机制

论文摘要

脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和附属结构是革兰氏阴性菌的膜壁结构组成部分,这些非必需结构消耗了大量的原料和能量。本课题以大肠杆菌(Escherichia coli K-12)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida KT2442)为出发菌,建立了适用于基因组精简的敲除系统,构建了一系列膜壁结构精简菌株,解析了膜壁结构关键分子对细菌细胞全局影响机制,并利用一些精简菌株作为宿主生产可降解生物塑料聚羟基脂肪酸酯(PHA)。本论文主要研究结论如下:(1)通过删除LPS合成关键基因rfaD构建了大肠杆菌LPS结构精简菌株,合成最简LPS结构,即Kdo2-lipid A,并通过基因工程改造提高Kdo2-lipid A合成量。在大肠杆菌K-12菌中,通过敲除核心糖中L-D-庚糖合成关键基因rfaD,获得LPS分子结构精简菌株WJW00。通过SDS-PAGE银染,薄板层析,和电喷雾电离质谱鉴定其LPS结构为Kdo2-lipid A。WJW00合成1.31μM(2.94μg/mL)的Kdo2-lipid A,较野生菌(2.02μM)合成的LPS分子数量降低了35.1%。与传统Kdo2-lipid A生产菌WBB06相比,WJW00无抗性,生长情况更好,因此WJW00是合适的Kdo2-lipid A生产菌株。在WJW00基础上进一步敲除LpxD的抑制蛋白Npr编码基因ptsO,Kdo2-lipid A产量提高93.2%,达到5.68μg/mL;过表达LPS翻转蛋白编码基因msbA,Kdo2-lipid A产量提高25.5%,达到3.69μg/mL;过表达Kdo2-lipid A合成关键基因lpxC,Kdo2-lipid A产量提高189.8%,达到8.52μg/mL。(2)通过代谢物变化分析及转录组学研究了大肠杆菌LPS分子结构精简对细胞全局调控及聚3-羟基丁酸酯(PHB)合成效率的影响。进一步研究大肠杆菌LPS分子结构精简对细胞膜壁组成、胞内代谢和PHB合成的影响。首次发现rfaD基因敲除不仅影响磷脂组分比例还影响磷脂结构。LPS精简菌株WJW00较野生菌端部更为平整,鞭毛、分泌物减少,膜壁厚度减小,细胞破碎率显著提高,外膜蛋白OmpF减少;WJW00还表现出更强的疏水性、外膜渗透性、自凝集能力和抗生素敏感性,菌膜形成能力显著降低。大肠杆菌中rfaD基因的敲除影响细胞代谢,精简菌株发酵过程中,糖耗降低,pH升高,副产物丙酮酸、乳酸和乙酸分别降低77.1%、11.9%和59.0%。乙酰辅酶A增加3.7倍;丙氨酸降低80.0%,GABA提高46.5倍。进一步结合转录组学分析得出LPS分子精简可使得胞内C:N比例增高。针对上述代谢产物的定量结果,我们推断LPS分子精简可能有利于PHB生产。经验证,WJW00/pDXW-8-phaCAB、WJD00/pDXW-8-phaCAB和WJJ00/pDXW-8-phaCAB的PHB产量可达到细胞干重的67.8%、78.6%、84.8%,其产量分别较对照菌W3110/pDXW-8-phaCAB、DH5α/pDXW-8-phaCAB和JM109/pDXW-8-phaCAB提高300%,80.0%,75.0%;产率系数分别提高2.5倍、1.9倍和1.8倍。这归因于三个因素:(ⅰ)细胞壁膜的刚性降低,更易拉伸以容纳更多的细胞内容物;(ii)细胞外膜结构减少节省了细胞能量和资源;(iii)PHB前体物质乙酰辅酶A更加充足,副产物乙酸和乳酸合成较少,胞内C:N比例提高。(3)研究了删除25个LPS合成相关基因对大肠杆菌细胞的全局调控影响及其高效合成PHB的机制。利用多元位点特异性重组系统构建LPS基因簇精简菌株WJW02,从原料和合成步骤上彻底阻断LPS核心糖和O-抗原的合成,深入研究膜壁组分和表型,发现WJW02在细胞形态、膜壁厚度、磷脂、外膜蛋白、鞭毛、菌毛、胞外多糖与W3110均有很大差异;进而发现一系列膜壁特性、耐酸性、内膜渗透性、环境pH值、耐药性差异等。发酵过程中胞内外代谢物检测发现WJW02胞内乙酰辅酶A含量增加、三种有机酸含量降低、丙氨酸含量减少、GABA含量增加。进一步通过全局转录组学分析发现删除25个LPS合成基因影响4149个基因转录,涉及膜壁结构鞭毛、菌毛、胞外多糖、膜蛋白等,也包括胞内C源代谢和N源代谢,还影响细胞胁迫抗逆系统和全局调控因子等。将LPS精简菌株WJW02作为宿主菌应用于PHB的生产,WJW02/pBHR68细胞体积较W3110/pBHR68增大约25倍,PHB合成达到细胞干重的82.4%。LPS结构的截断可以大幅度提高PHB的生产效率。(4)通过删除59个鞭毛合成相关基因和9个菌毛合成相关基因改善大肠杆菌细胞特性来提高PHB合成效率。在W3110中,通过CRISPR/Cas9敲除系统分别删除59个和9个基因,获得鞭毛精简菌株WJW010和菌毛精简菌株WJW011。与W3110相比,WJW010细胞鞭毛缺失,运动性完全丧失,疏水性下降10.2%,菌膜形成量降低45.0%;WJW011的疏水性下降18.4%,菌膜形成量降低82.2%。这些基因簇的精简对细胞其他膜壁结构LPS、磷脂和外膜蛋白OmpF合成无影响,对其他膜壁表型无影响。在胞内代谢方面的影响,与W3110相比,WJW010细胞生长更快,糖耗降低,丙氨酸降低10.0%,GABA提高60.5%;WJW011细胞糖耗轻微降低;丙氨酸降低10.0%,GABA提高99.8%。引入PHB合成基因簇后,鞭毛基因簇精简使得细胞干重提高68.0%、PHB含量提高了11.5倍,为细胞干重的18.7%,但菌毛基因簇的精简对PHB合成影响较小。鞭毛基因簇的精简可以促进大肠杆菌合成PHB。在LPS精简菌株WJW02中继续删除68个鞭毛和菌毛合成基因,PHB合成情况基本与WJW02一致。(5)建立了两套适用于恶臭假单胞菌KT2442的基因组精简系统,并通过删除76个鞭毛和菌毛相关基因改善细胞特性,提高了PHA合成效率。精简系统I包括pK18mobsacB、pWJW101和pWJW102;精简系统II包括pZJD29c、pDTW202和pWJW103。通过敲除鞭毛结构基因PP4378并对比精简系统I、II与传统敲除系统的效率,结果显示:精简系统II中第一轮重组效率更高,精简系统I和II的二、三轮重组效率均可达到90%。最终采用精简系统II,高效连续删除菌毛基因簇PP2357-PP2363和鞭毛基因簇PP4329-PP439,获得菌株WJPP02和WJPP03。其中WJPP03缺失76个基因,占基因组比例为1.2%,WJPP03较KT2442生长情况改善、鞭毛和运动性缺失、菌膜形成能力降低、胞内信号因子c-di-GMP含量降低。WJPP03的PHA产量增加,添加C6底物己酸钠时,生物量提高19.1%,PHA产量提高73.4%;添加C12底物月桂酸时,生物量提高11.4%,PHA产量提高53.6%。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  •   1.1 革兰氏阴性细菌LPS研究进展
  •     1.1.1 LPS分子的结构及其合成途径
  • 2-lipid A分子的合成途径及其功能'>    1.1.2 Kdo2-lipid A分子的合成途径及其功能
  •     1.1.3 多糖链分子的合成途径及其功能
  •     1.1.4 LPS分子的生物功能
  •   1.2 磷脂的合成途径及功能
  •     1.2.1 磷脂组分的合成途径
  •     1.2.2 磷脂的功能
  •     1.2.3 磷脂和类脂A中脂肪酸链的合成途径
  •   1.3 附属结构的合成途径及功能
  •     1.3.1 鞭毛的合成途径及功能
  •     1.3.2 菌毛的合成途径及功能
  •   1.4 外膜蛋白及其功能
  •   1.5 菌膜的形成及其与外膜分子的关系
  •   1.6 革兰氏阴性菌基因组精简优化研究进展
  •     1.6.1 基因组必需基因
  •     1.6.2 基因组精简策略
  •     1.6.3 革兰氏阴性菌基因组精简现状
  •   1.7 聚羟基脂肪酸酯(PHA)的合成及应用研究进展
  •     1.7.1 聚羟基脂肪酸酯的合成
  •     1.7.2 聚羟基脂肪酸酯的代谢改造研究进展
  •   1.8 PHA合成与LPS合成的关系
  •   1.9 本论文的研究意义和研究内容
  •     1.9.1 立题依据和研究意义
  •     1.9.2 研究内容
  • 2-lipid A生产菌株的构建'>第二章 大肠杆菌结构精简LPS分子-Kdo2-lipid A生产菌株的构建
  •   2.1 引言
  •   2.2 材料和方法
  •     2.2.1 菌株、质粒和引物
  •     2.2.2 试剂和仪器
  •     2.2.3 培养基和培养条件
  •     2.2.4 分子生物学基本操作
  •     2.2.5 大肠杆菌rfaD基因敲除突变菌株的构建
  •     2.2.6 大肠杆菌WJW00 LPS结构的小量制备及SDS-PAGE银染分析
  • 2-lipid A和 Lipid A的提取与薄板层析(TLC)分析'>    2.2.7 大肠杆菌Kdo2-lipid A和 Lipid A的提取与薄板层析(TLC)分析
  • 2-lipid A和 Lipid A的电喷雾电离质谱ESI/MS和 ESI/MS/MS分析'>    2.2.8 大肠杆菌Kdo2-lipid A和 Lipid A的电喷雾电离质谱ESI/MS和 ESI/MS/MS分析
  •     2.2.9 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
  •     2.2.10 大肠杆菌Kdo定量
  •   2.3 结果和分析
  • 2-lipid A生产菌株WJW00 的构建'>    2.3.1 大肠杆菌Kdo2-lipid A生产菌株WJW00 的构建
  • 2-lipid A'>    2.3.2 通过SDS-PAGE和 TLC鉴定突变菌株WJW00 合成Kdo2-lipid A
  • 2-lipid A'>    2.3.3 通过ESI/MS和 ESI/MS/MS鉴定WJW00 合成Kdo2-lipid A
  • 2-lipid A合成量'>    2.3.5 改造WJW00 以提高Kdo2-lipid A合成量
  •   2.4 讨论
  •   2.5 本章小结
  • 第三章 大肠杆菌LPS分子结构简化对细胞全局调控及PHB合成的影响
  •   3.1 引言
  •   3.2 材料和方法
  •     3.2.1 菌株
  •     3.2.2 主要试剂和仪器
  •     3.2.3 培养基和培养条件
  •     3.2.4 分子生物学基本操作
  •     3.2.5 大肠杆菌LPS的提取及结构鉴定
  •     3.2.6 大肠杆菌出发菌株的电镜观察
  •     3.2.7 大肠杆菌合成PHB的光学显微镜、电镜及激光共聚焦显微镜观察
  •     3.2.8 大肠杆菌磷脂组分的HPLC定量和ESI/MS结构分析
  •     3.2.9 外膜蛋白的提取及结构鉴定
  •     3.2.10 大肠杆菌WJW00 菌株细胞表型分析
  •     3.2.11 大肠杆菌合成PHB发酵参数测定
  •     3.2.12 大肠杆菌胞内乙酰辅酶A的提取及定量
  •     3.2.13 胞内PHB的提取及气象色谱定量
  •     3.2.14 大肠杆菌转录组分析
  •   3.3 结果和分析
  •     3.3.1 其他大肠杆菌LPS分子精简菌株的构建
  •     3.3.2 细胞形态及外膜上蛋白分析
  •     3.3.3 细胞膜壁磷脂的含量、组分比例和结构鉴定及分析
  •     3.3.4 细胞膜壁特性分析
  •     3.3.5 LPS分子精简对细胞胞内代谢影响
  •     3.3.6 突变株WJW00 胞内碳源代谢的转录组分析及胞内乙酰辅酶A合成分析
  •     3.3.7 LPS分子精简显著促进大肠杆菌合成PHB
  •     3.3.8 精简大肠杆菌DH5α和 JM109的LPS结构高效促进PHB合成
  •     3.3.9 LPS分子精简对细胞全局调控和高效合成PHB的机制分析
  •   3.4 讨论
  •   3.5 本章小结
  • 第四章 删除大肠杆菌基因组中25个LPS合成相关基因对细胞全局调控及PHB合成的影响
  •   4.1 引言
  •   4.2 材料和方法
  •     4.2.1 菌株、质粒和引物
  •     4.2.2 主要试剂
  •     4.2.3 主要仪器
  •     4.2.4 培养基和培养条件
  •     4.2.5 分子生物学操作
  •     4.2.6 大肠杆菌LPS的提取及结构鉴定
  •     4.2.7 大肠杆菌出发菌株的电镜观察
  •     4.2.8 大肠杆菌光学显微镜、电镜及激光共聚焦显微镜观察
  •     4.2.9 大肠杆菌磷脂的提取及定量
  •     4.2.10 外膜蛋白的提取及结构鉴定
  •     4.2.11 大肠杆菌膜壁特性及细胞表型的测定
  •     4.2.12 发酵参数测定
  •     4.2.13 胞内乙酰辅酶A的测定
  •     4.2.14 胞内PHB的提取及气象色谱定量
  •     4.2.15 大肠杆菌转录组分析
  •   4.3 结果和分析
  •     4.3.1 删除大肠杆菌25个LPS合成基因以构建精简菌株WJW
  •     4.3.2 删除25 个基因后对大肠杆菌膜壁结构的影响
  •     4.3.3 不同生长时期精简菌株WJW02 的磷脂组分和结构分析
  •     4.3.4 精简菌株WJW02 细胞形态及运行性和胞外分泌物分析
  •     4.3.5 精简菌株WJW02 细胞的膜壁特性及耐药性分析
  •     4.3.6 精简菌株WJW02的M9G发酵和胞内代谢分析
  •     4.3.7 转录组学差异基因的聚类分析和富集分析
  •     4.3.8 胞内碳源和氮源代谢途径的转录组差异分析
  •     4.3.9 删除25个LPS合成基因显著提高PHB的合成能力
  •     4.3.10 删除25个LPS合成基因对细胞全局调控并高效合成PHB的机制解析
  •   4.4 讨论
  •   4.5 本章小结
  • 第五章 通过删除大肠杆菌59 个鞭毛合成相关基因和9 个菌毛合成相关基因提高PHB合成效率
  •   5.1 引言
  •   5.2 材料和方法
  •     5.2.0 菌株和质粒
  •     5.2.1 工具酶和试剂
  •     5.2.2 主要仪器
  •     5.2.3 培养基和培养条件
  •     5.2.4 基本分子生物技术操作
  •     5.2.5 大肠杆菌中CRISPR/Cas9 敲除流程
  •     5.2.6 大肠杆菌附属结构精简菌株的透射电镜观察
  •     5.2.7 大肠杆菌光学显微镜、电镜及激光共聚焦显微镜观察
  •     5.2.8 大肠杆菌磷脂的提取、定量及结构分析
  •     5.2.9 大肠杆菌外膜蛋白的提取及结构鉴定
  •     5.2.10 大肠杆菌膜壁特性及细胞表型的测定
  •     5.2.11 发酵参数测定
  •     5.2.12 胞内PHB的提取及气象色谱定量
  •   5.3 结果和分析
  •     5.3.1 通过在大肠杆菌中W3110和WJW02 中鞭毛和菌毛合成基因的删除
  •     5.3.2 菌体形态及运动性分析
  •     5.3.3 细胞表型分析
  •     5.3.4 细胞胞内代谢分析
  •     5.3.6 删除大肠杆菌59 个鞭毛合成基因和9 个菌毛合成基因对PHB合成的影响
  •   5.4 讨论
  •   5.5 本章小结
  • 第六章 通过删除恶臭假单胞菌基因组中76个鞭毛和菌毛合成相关基因提高PHA合成效率
  •   6.1 引言
  •   6.2 材料与方法
  •     6.2.1 菌株、质粒和引物
  •     6.2.2 工具酶和试剂
  •     6.2.3 主要仪器
  •     6.2.4 培养基和培养条件
  •     6.2.5 敲除系统中工具质粒和敲除质粒的构建
  •     6.2.6 敲除恶臭假单胞菌鞭毛合成基因PP4378 的三种方法
  •     6.2.7 删除恶臭假单胞菌76 个菌毛和鞭毛合成基因构建精简菌株WJPP02 和WJPP03
  •     6.2.8 细胞电镜观察和运动性分析
  •     6.2.9 胞外分泌蛋白的提取及SDS-PAGE分析
  •     6.2.10 胞外分泌蛋白条带的MALDI-TOF/MS分析
  •     6.2.11 RT-PCR分析
  •     6.2.12 胞内c-di-GMP的提取和LC-MS分析
  •     6.2.13 细胞菌膜形成能力的测定
  •     6.2.14 胞内PHA颗粒的提取、纯化和组分分析
  •   6.3 结果与分析
  •     6.3.1 含loxL-gm-loxR的模板质粒pWJW101 的构建
  •     6.3.2 敲除质粒pWJW200,pWJW201,pWJW202,pWJW203,pWJW204 的构建
  •     6.3.3 Cre-SacB表达质粒pWJW102和p WJW103 的构建
  •     6.3.4 恶臭假单胞菌中PP4378 基因的敲除及三种敲除系统的比较
  •     6.3.5 连续删除恶臭假单胞菌KT2442中7 个菌毛和69 个鞭毛相关基因构建菌株WJPP02 和WJPP03
  •     6.3.6 恶臭假单胞菌附属结构基因的敲除对细胞生长、鞭毛合成、运动性和上清液蛋白质的影响
  •     6.3.7 恶臭假单胞菌鞭毛和菌毛基因敲除对菌膜形成及胞内信使分子c-di-GMP合成的影响
  •     6.3.8 删除76 个恶臭假单胞菌附属结构相关基因显著提高胞内PHA颗粒的积累
  •     6.3.9 恶臭假单胞菌KT2442 和精简菌株WJPP03 合成PHA的摇瓶发酵
  •   6.4 讨论
  •   6.5 本章小结
  • 主要结论与展望
  •   主要结论
  •   展望
  • 论文主要创新点
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录 :作者在攻读博士学位期间发表的论文
  • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 王建莉

    导师: 王小元

    关键词: 大肠杆菌,恶臭假单胞杆菌,膜壁结构,鞭毛,菌毛,胞内代谢,聚羟基脂肪酸酯,转录组学分析

    来源: 江南大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学,生物学

    单位: 江南大学

    分类号: Q814;Q78

    总页数: 175

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