CRISPR-Cas9系统：应用于酿酒酵母的一步多靶点基因编辑技术

论文摘要

随着DNA合成和测序的快速发展,菌株改造开始成为代谢工程和合成生物学中的限速步骤。我们开发了一种称为gRNA-tRNA-array Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas9（GTR-CRISPR）的系统,用tRNA序列将多个gRNA串联起来表达,极大提高了在酿酒酵母中的基因编辑数目和效率。利用此系统,在获得引物后7天内,能够构建出质粒并同时编辑8个基因,效率为87%,为目前世界上在酿酒酵母中编辑效率最高和数目最多的基因编辑体系。我们进一步开发了一种更快捷的GTR-CRISPR系统,通过将Golden Gate反应液直接转化入酵母,跳过了大肠杆菌中的构建质粒步骤,极大地节约了时间。利用快速方法,我们能够在获得引物后3天内同时编辑6个基因,效率为60%,即使是未优化的gRNAs效率也能达到23%。我们利用该系统来简化酵母脂质代谢网络,仅在10天内就完成了对8个基因的删除,提高了游离脂肪酸产量约30倍。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 研究背景
•   1.2 CRISPR-Cas9系统的原理
•   1.3 酿酒酵母的介绍
•   1.4 CRISPR-Cas9系统在酿酒酵母中的应用
•   1.5 gRNA的两种表达策略
•   1.6 前人的研究成果
•   1.7 gRNA靶向序列的设计
•   1.8 Donor的设计与制备
•   1.9 立题的目的及意义
•   1.10 本论文的研究内容
•   1.11 课题的创新之处
• 第二章 常规实验方法
•   2.1 仪器
•   2.2 试剂
•   2.3 培养基
•   2.4 PCR
•     2.4.1 扩增PCR
•     2.4.2 验证PCR
•     2.4.3 实时荧光定量PCR
•     2.4.4 供体DNA PCR
•   2.5 PCR产物纯化
•   2.6 琼脂糖凝胶电泳
•   2.7 DNA产物的胶回收
•   2.8 Nanodrop one浓度测定
•   2.9 质粒构建
•     2.9.1 NEBuilder方法构建质粒
•     2.9.2 Golden Gate方法构建质粒
•   2.10 制备感受态
•     2.10.1 细菌stable感受态的制备
•     2.10.2 酿酒酵母电转感受态的制备
•   2.11 转化
•     2.11.1 细菌化学转化
•     2.11.2 酵母化学转化
•     2.11.3 酵母电转化
•   2.12 质粒提取
•   2.13 酵母快速全基因组提取
•   2.14 细胞浓度测定
•   2.15 摇瓶发酵
•   2.16 细胞干重测量
•   2.17 总脂肪酸产量测定
•   2.18 游离脂肪酸产量测定
• 第三章 GTR-CRISPR系统对酿酒酵母的基因编辑
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 实验菌株
•     3.2.2 实验引物
•     3.2.3 培养基
•   3.3 实验质粒构建及转化
•   3.4 基因编辑效率的计算
•   3.5 酿酒酵母中3-5种基因同时编辑
•   3.6 实验结果
•     3.6.1 三种基因同时编辑结果
•     3.6.2 四种基因同时编辑结果
•     3.6.3 五种基因同时编辑结果
•     3.6.4 分析与讨论
•   3.7 GTR-CRISPR对酿酒酵母中6-8种基因同时编辑
•   3.8 实验结果
•     3.8.1 GTR-CRISPR对6-8种基因的编辑
•     3.8.2 GTR-CRISPR对6种基因编辑的改进
•     3.8.3 GTR-CRISPR对8种基因编辑的改进
•     3.8.4 分析与讨论
•   3.9 GTR-CRISPR对4种基因进行ORF缺失
•   3.10 小结
• 第四章 Lightning GTR-CRISPR系统对酿酒酵母的基因编辑
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 实验菌株
•     4.2.2 实验引物
•     4.2.3 培养基
•     4.2.4 酵母电转
•     4.2.5 基因编辑效率的计算
•   4.3 Lightning GTR-CRISPR系统对4种基因同时编辑
•   4.4 Lightning GTR-CRISPR系统对5种基因同时编辑
•   4.5 Lightning GTR-CRISPR系统对6种基因同时编辑
•     4.5.1 KlURA3和ScHIS3双标记对6种基因同时编辑
•     4.5.2 KlURA3和ScLEU2双标记对6种基因同时编辑
•     4.5.3 KlURA3和ScLEU2双标记对6种HIS基因同时编辑
•   4.6 Lightning GTR-CRISPR系统对4种基因ORF同时缺失
•   4.7 小结
• 第五章 Lightning GTR-CRISPR在脂质代谢网络中的应用
•   5.1 引言
•   5.2 实验材料
•     5.2.1 实验菌株
•     5.2.2 实验引物
•     5.2.3 培养基
•     5.2.4 酵母电转
•   5.3 实验结果
•   5.4 小结
• 第六章 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 作者和导师简介
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 汪娟

导师: Jens Nielsen

关键词: 多重基因组编辑,无质粒构建,酿酒酵母

来源: 北京化工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 北京化工大学

分类号: Q78

DOI: 10.26939/d.cnki.gbhgu.2019.001622

总页数: 96

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