Pseudomonas putida KT2440低特异性L-苏氨酸醛缩酶的表达、酶学性质及温度稳定性提高

论文摘要

【目的】从Pseudomonas putida KT2440基因组中,钓取低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因（lta E）,构建重组大肠杆菌。研究目标酶的酶学性质,和关键氨基酸位点突变对酶活和温度稳定性的影响。【方法】以P. putida KT2440基因组DNA为模板,PCR扩增出lta E基因,构建重组表达质粒p ET28a-KT2440并转化Escherichia coli BL21 （DE3）,获得重组菌E. coli BL21 （DE3）/p ET-KT2440,利用Ni2+柱亲和层析纯化低特异性L-苏氨酸醛缩酶（LTA）,对关键氨基酸位点Thr206和Lys207实施定点突变。【结果】SDS-PAGE结果表明LTA在大肠杆菌中获得高效表达,分子量为40k Da左右,与理论值大小相符。Ni2+柱亲和层析纯化LTA,获得单一条带。利用双酶耦联法测得LTA酶活为5577.3U/mg,最适反应温度为50°C,最适p H为8.0。在温度低于45°C,p H 5.0-9.0时,重组酶较稳定。LTA酶的Km和kcat值为23.95 mmol/L和19216.6 s–1。Mg2+、Ca2+金属离子对LTA有明显的促进作用,而Ni2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+等对酶有明显的抑制作用。该酶在叔丁基甲基醚溶剂中具有良好的耐受性,在叔丁基甲基醚中保存1h后仍保留90%以上的酶活。Thr206Ser突变明显提高了酶对温度的稳定性。Lys207对酶催化功能是必需的,该位点突变对酶活都是致死的。【结论】克隆并表达P. putida KT2440的LTA酶,研究了酶学性质,通过定点改造提高了酶的温度稳定性,筛选获得一种酶耐受性好的有机溶剂,为LTA酶在有机溶剂中高效稳定催化β-羟基-α-氨基酸奠定了较坚实的研究基础。

论文目录

• 1 材料和方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 菌株和质粒:
•     1.1.2 主要试剂和仪器:
•   1.2 重组菌E.coli BL21（DE3）/pET-His-KT2440的构建
•   1.3 菌体的培养及蛋白表达
•   1.4 蛋白纯化
•   1.5 酶活力的测定
•   1.6 酶的最适反应温度及温度稳定性
•   1.7 酶的最适反应pH及pH稳定性
•   1.8 LTA动力学参数的测定
•   1.9 LTA对有机溶剂的耐受性
•   1.1 0 二价金属离子对LTA的影响
•   1.1 1 LTA关键氨基酸位点的突变
•   1.1 2 圆二色谱测定突变酶的变性温度
• 2 结果和分析
•   2.1 LTA的蛋白表达、纯化及酶活测定
•   2.2 LTA的最适反应温度和温度稳定性
•   2.3 LTA的最适反应pH和pH稳定性
•   2.4 LTA动力学参数的测定
•   2.5 LTA的有机溶剂耐受性
•   2.6 二价金属离子对LTA的影响
•   2.7 Thr206和Lys207定点突变
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 李利宏,张荣珍,周丽仙,柳志永,旋凯昂,饶俊超,徐岩

关键词: 恶臭假单胞菌,低特异性苏氨酸醛缩酶,酶学性质,致死突变,温度稳定性

来源: 微生物学报 2019年10期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江南大学生物工程学院教育部工业生物技术重点实验室

基金: 国家自然科学基金(31370100),江苏省六大人才高峰高层次人才资助项目(2015-SWYY-010),高等学校学科创新引智计划资助(111-2-06)~~

分类号: Q55

DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20180546

页码: 2013-2023

总页数: 11

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